诊断肝纤维化的方法与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

本发明涉及肝脏病学和肝纤维化的领域。特别涉及一组可以用于 诊断肝纤维化的血清学标记，特别用于诊断由于慢性HCV感染引起 的肝纤维化。这些标记可以用于监控肝纤维化的治疗处理。

发明背景

将纤维化肝病列为全世界死亡率第八大常见诱因，每年占1.3百万 死亡（Murray 和 Lopez, 1997，Lancet 349，1269-1276)。纤维化的 细胞机理是复杂的。响应例如由慢性丙肝病毒（HCV)感染、乙肝病 毒（HBV)感染、酒精或脂肪肝病、药物诱导的肝病或初期胆汁性肝 硬化引起的肝损伤，将通常静止的肝星状细胞激活成增殖的肌成纤维 细胞。这些细胞产生胞外基质蛋白并释放金属蛋白酶的组织抑制剂， 其结合并钝化引起疤痕退化的金属蛋白酶。结果，通过组织和蛋白样 胶原蛋白增加的产生和这些化合物降低的降解，纤维化和疤痕累积， 使得肝功能受损（McHutchinson2004，CME Newsletter Tx Reporter Gastroenterology, 2-4 )„

尽管肝纤维化是引起胞外基质累积的可逆过程，但肝硬化是不可 逆的过程，其特征在于完全围绕实质的基质厚条带形成结节。如果顺 其自然不治疗，肝纤维化导致肝硬化，可能癌症。出于这些原因，肝 纤维化及时而准确的诊断对于有效的医疗处理是必要的。

目前仍然认为肝活组织检查是用于检测纤维化和炎症的所谓黄金 标准。推荐肝活组织检查来将疾病评级和分阶段，证实诊断并建立基 准，相对于此来证明改善或疾病进展，帮助测定预后和治疗的需要 (McHutchinson，参见上文；对于综述，参见 Gebo 等，²〇02 Hepatology 36, 161-172 )。

存在多种已经用于半定量慢性丙肝患者肝纤维化和炎症程度的组 织学分级系统。最常用的分级系统之一是METAVIR系统（Bedossa 等，1994，Hepatlogy, 20，15-20)。METAVIR 将肝纤维化分成 F0 至F4的5个阶段。F0表示无纤维化，F1对应轻度纤维化（门静脉纤

维化但没有隔膜）。中度至严重纤维化归类为F2至F4 (F2:少数隔 膜，F3:很多隔膜但没有硬化），阶段F4对应肝硬化的最后阶段。认 为纤维化从F22在临床上开始明显。

但是在应用肝活组织检查诊断和分级纤维化中存在几个缺陷。肝 纤维化常受到取样误差，使得小部分的样品不能反映整个肝脏中的真 实情况。因而，不是持续退化的动态过程的准确标记。此外，病理学 家在他们判断组织学样品的数据时通常不一致，其中在10%至20% 的活组织检查中产生观察者内和观察者间的可变性（Cadranel等 2000，Hepatology 32，477-481 )。

肝活组织检查对于患者是入侵性的且疼痛的程序。而且与取样后 出血和其它并发症的风险相关。此外和部分地由于预期的并发症后患 者住院，这是成本高的方法。

肝纤维化是慢性HCV感染的主要并发症，导致肝硬化和代偿失调 肝病的产生。因此检测纤维化的产生和进展的的定向研究对于这些患 者的有效控制是必要的。最好是用非入侵性的能够区别纤维化中间阶 段的测试来完成渐进性纤维化的评价。已经公开了各种单一标记和标 记组算法，但是目前没有可以可靠预测纤维化的有效单一生物标记或 生物标记评分可用（诊断准确性>80%)。肝纤维化非入侵性动态测量 发展的进一步研究的在2002年受到National Institute of Health Consensus Development Conference的强烈鼓励。特别是关于肝活组 织检查可替换方案的研究应当提供关于活组织检查方法足够详细的内 容（活组织检查样品的平均大小；组织学上充分表征的定量图）来使 阅读器确信参照标准的适合性。肝活组织检查强烈依赖于最佳化的性 能标准并可能由于观察者之间的可变性和太小的样品大小 导致组织学阶段的错误分类。

对于反映肝病中纤维化过程并可以作为肝活组织检查替代的生物 化学或血清学标记存在广泛的研究。在最近几年，已经研究了几个非 入侵性或最小入侵性的生物化学和血清学标记来帮助诊断肝病。特别 是，已经将标记的组合物用于将患者分类，根据他们的纤维化阶段或 程度。

US6,631,330公开了使用至少4种选自a-2-巨球蛋白、天门冬氨鷗 盐氨基转移酶、Y-谷氨酰转肽酶、Y-球蛋白、总胆红素、白蛋白、al-

球蛋白、a2-球蛋白、结合珠蛋白、|5-球蛋白、apoAl、IL-10、TGF-|31、 apoA2和ApoB的生化标记的组合。在数学上合并所获得的这些标记 中4种的值来测定肝纤维化的存在。使用该标记组，可以获得约80% 的诊断准确性。

国际专利申请W02003/073822描述了诊断患者肝纤维化存在或严 重程度的方法。该方法使用至少三种标记的结合，这三种标记是a-2- 巨球蛋白、透明质酸和金属蛋白酶1的组织抑制剂（TIMP-1)。使用 该方法，可以获得约80%的诊断准确性（Me Hutchinson, 2004，参 见上文）。

存在产生非入侵性或最小入侵性方法的需要来达到比迄今为止现 有技术中已知的更高的肝纤维化测定中的诊断准确性并以更可靠的方 式来归类和区分纤维化的不同阶段，使得在治疗过程中监控纤维化的 临床发展成为可能。此外，这样的方法应当适于自动化分析仪上的连 续测试。

发明描述

通过根据本发明的方法解决了该问题。该方法用于检测患者中肝 病的存在和/或严重程度，包括如下的步驟：

1.  从所述患者获得分离的样品，

2.  测量所述样品中的TIMP-1 (金属蛋白酶I的组织抑制剂），

3.  测量所述样品中的铁蛋白，

4.  测量所述样品中至少一个选自A2M (a-2-巨球蛋白）、PI (凝 血酶原指数）的其他参数，

5.  任选地测量所迷样品中至少一个其他的生化或临床参数，

6.  基于TIMP-1、铁蛋白和根据步骤d)和e)所测量参数的存在 或测量水平来诊断肝病的存在和/或严重程度。

本发明允许F0/F1纤维化与F2/F3/F4阶段之间确实的区分。此外， 可以通过本发明的方法进行作为肝病医疗处理控制的治疗监控。

本发明的方法与充分表征的肝纤维化的Metavir阶段高度相关。 与现有技术的方法相比较，本发明方法的特定优势是使用了定量组来 最小化病理观察的错误分类和统计模型的误差。

本发明的方法包括与通过几种方法测定的纤维化严重程度非常接

近一致的非入侵性方法，这几种方法为：肝活组织检查和更多的方法 如测定纤维化面积。

本发明的方法基于患有充分表征肝纤维化（涵盖全部范围的 Metavir阶段）的患者标本和由于组织学测定没有肝纤维化的患者标 本（Metavir评价：0)的统计学相关群组。样本的最初选择标准是 Metavir评分。在双重评价和使用大小大于15mm标本的最佳化方式 中证实了这种参照。

本发明的方法允许纤维化的缺失预测，具有至少82%，优选至少 84%的诊断准确性（DA)。由于对于纤维化阶段的任意错误分类并进 一部导致患者疼痛和健康风险，即使该参照标准不是肝纤维化的黄金 标准，本发明的方法表示了活组织检查的可替换方案。

该方法允许研究纤维化的产生和进展，提供慢性HCV患者的有效 监控。与活组织检查相比较，可以以短的时间间隔来慢性HCV患者 的疾病监控进行。该方法允许监控抗纤维化治疗的成功。

该方法还允许研究慢性肝损伤患者中纤维化的产生和进展。这是 相对常见的具有最小症状的失调，还具有相当大的发病率和死亡率的 长期风险，通过进行中的肝坏死和肝炎症在病理学上将其限定，通常 伴随纤维化。HCV是最常见形式的慢性肝损伤。可以将该方法运用 至更多形式的慢性肝损伤：酒精性脂肪肝炎（ASH)、酒精性脂肪肝 疾病（AFLD)、非酒精性脂肪肝炎（NASH)或非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)。本发明的方法可以用于监控NASH和NAFLD的严重程 度。它们可以用于诊断病毒性如曱肝、乙肝、丙肝或丁肝病毒或人免 疫缺陷病毒（HIV)肝炎、慢性迁延性或慢性活动性肝炎、自体免疫 肝病如自体免疫肝炎和药物诱导的肝病；原发性胆汁性肝硬化、胆道 闭锁、由医疗处理引起的肝病或先天性肝病个体中的肝纤维化。本发 明可以用于监控具有肝病风险的药物的治疗。该方法可以用于诊断纤 维化的存在或严重程度和用于监控纤维化，其中纤维化与各种纤维化 失调相关，不限于肝：肺纤维化、肾纤维化、前列腺纤维化和乳房纤 维化以及另一种失调中的纤维化。

根据本发明，优选的参数组合是TIMP-1、铁蛋白和A2M (也称 为 SNIFF 3a，SNIFF 是 score non-invasif de fibrose du foie 的法文缩 写；英文为：肝纤维化的非入侵性评价），具有82.6%的诊断准确性；

TIMP-1、铁蛋白和PI( SNIFF 3 ),具有84%的诊断准确性；和TIMP-1、 铁蛋白、PI、PLT、尿素、年龄，具有84.7%所诊断准确性。这些优 选的组合还可以参见表3。

在本发明的意义上，应当如下理解特定的术语和表述：

诊断准确性（DA)是测试本身的准确性。这意思是真阳性或真阴 性的所有测试的百分比。诊断准确性越高，测试的结果越可靠。将DA 计算为真阳性和真阴性的总合除以样品结果的总数并受到所分析人群 中纤维化发病率的影响。

Cut-off值是单个生物标记或几个生物标记组合的算术计算浓度， 用于区别健康和患病状态。在本发明的理解中，cut-off是0.5的值。 如果该值高于或等于0.5 (20.5),这意味着达到了 Metavir阶段F2， 用于区分无或轻度纤维化（Metavir阶段F0或F1)与临床上明显的 纤维化 CFS (Metavir 阶段 F2，F3, F4 )。

阳性预测值（PPV)是真阳性测试的阳性百分比。

阴性预测值（NPV)意思是真阴性测试的阴性百分比。

评分意思是纤维化相关的几个生物标记的算术组合。特别地，在 此所用的评分具有0 (最小纤维化）至1 (CSF:临床上明显的纤维化） 的范围。

AUROC意思是受试者工作特征曲线下的面积。这些曲线中，将 敏感性对特异性倒数作曲线。1.00ROC曲线下的面积表示理想的100% 敏感性和100%特异性。曲线开始处的斜率越大，测试的敏感性和特 异性之间的相关性越好。

敏感性是产生患病或风险因素或其他健康状况患者的阳性测试概 率。

特异性是产生不患病患者的阴性测试概率。

TIMP-1 (金属蛋白酶I的组织抑制剂）是具有28.5kDa分子量的 184个氨基酸的唾液酸糖蛋白（参见，例如，Murphy等Biochem J. 1981, 195, 167-170)，其抑制金属蛋白酶，如间质胶原酶MMP-1或 基质酶或明胶酶B。在本发明的理解中，术语TIMP-1包括具有与人 TIMP-1显著结构同源性的蛋白质，抑制金属蛋白酶的蛋白水解活性。 可以使用特异性检测TIMP-1抗原决定部位的抗体来检测人TIMP-1 的存在。还可以通过相关核酸如相应mRNA的检测来测定TIMP-1。

铁蛋白是具有至少440kD分子量的大分子，取决于铁含量，并由 24个亚基的蛋白外壳（去铁铁蛋白）和含有平均约2500个Fe³⁺离子 的铁核心构成（在肝脏和脾脏的铁蛋白中）。铁蛋白易于形成寡聚物。 借助于等电聚焦可以区分出至少20种异铁蛋白。这种微观不均一性 是由于酸性H和弱碱性L亚基含量的差异而引起的。碱性异铁蛋白 负责长期铁存储的功能，且主要发现于肝脏、脾脏和骨髓中。

铁蛋白的测定对于确定铁代谢的情况是合适的方法。治疗开始时 的铁蛋白测定提供了身体储备的代表性测量。临床上，已经证明了约 20ng/ml的极限值在潜伏前的铁缺乏检测中是有用的。该值提供了可 以动用来用于血红蛋白合成的铁储备耗尽的可靠指示。将潜伏的铁缺 乏定义为低于12ng/ml的极限。对于体内铁超负荷的表现，认为高于 400ng/ml的极限值是有用的。

对于铁蛋白的检测，可以使用传统的夹层免疫测试，其中使用两 个铁蛋白特异性的抗体来形成测试中的夹层复合物。抗体之一结合固 相，另一个抗体携带标记，使用该标记的信号作为检测铁蛋白存在的 方式。

PI (凝血酶原指数）用于检测凝血系统中的干扰并可以通过以下 方法来测定：将凝血活酶加入血浆样品中并测量以秒计的凝固时间（称 为Quick-time)。将该值与包含考虑所用凝血活酶敏感性的校正系数 的国际标准化比例联系起来。

A2M (a-2-巨球蛋白）是保守的蛋白质，大量存在于血浆中，作 为蛋白酶结合蛋白以从组织流体中清除活性蛋白酶。A²M没有钝化 蛋白酶的催化活性而是通过围绕蛋白酶折叠来物理诱捕目标蛋白酶而 起作用的。因此空间上防止通过A2M诱捕的蛋白酶分裂其底物蛋白^ 在本发明的意义上，可以根据本领域技术人员已知的测试形式通过免 疫测试使用特定抗体来检测A2M。还可以通过相关核酸如相应mRNA 的检测来测定A2M。

根据本发明，可以测定其它的生化或临床参数。其它生化参数可 以是与肝脏的新陈代谢或结构直接或间接相关的任何参数，例如尿 素、GGT (y-谷氨酰转肽酶）、透明质酸盐、AST (天冬氨酸盐氨基 转移酶）、MMP-2 (基质金属蛋白酶-2)、ALT (丙氨酸氨基转移酶）、 PIIINP(III型前胶原的N-端前肽）、胆红素、结合珠蛋白、ApoAl、

PLT (血小板数量）。还可以测定hepcidin或脂联素。

Hepddin是肝蛋白，最初鉴定为循环抗微生物肽。它在身体的铢 蓄积至肠吸收细胞的流通中是重要的参与者。脂联素是通过脂肪细胞 分泌的并以相对高的全身浓度循环来影响代谢功能。降低的血清脂联 素水平意味着提高的疾病风险，例如非酒精性脂肪肝病（NAFLD) 或非酒精性脂肪性肝炎（NASH)的严重程度。

可以测定其它的临床参数，如患者的年龄、性别、体重、营养习 惯。

通过可购得的测试试剂盒，通过本领域技术人员已知的免疫或光 度计方法来测定尿素、GGT(y-谷氨酰转移酶）、透明质酸盐、AST (天冬氨酸盐氨基转移酶）和ALT (丙氨酸氨基转移酶）、MMP_2、 PIIINP、胆红素、结合珠蛋白、ApoAl、hepcidin和脂联素。在适用 的情况中，用于检测分析物或参数（如相应mRNA)特异性核酸的杂 交技术也可用于测定参数。

PLT (血小板数量）是血小板数量并使用可购得的计数器计数血 小板来测定。

本发明使用多个参数的测定。因此，本发明那些可以以使用固相 的测试形式进行的生化和血清学参数的测定优选在如US200：3/001⁷⁶1⁶ 或W099/67643中所述的基于小型化矩阵的测试系统上进行。这些测 试系统具有多个空间上限定的测试区，其中各自可以用于检测单个特 异性的分析物或参数。因此，在单轮测试中可以检测多个分析物。

理解术语固相上限定的测试区意思是包括固相限定区域的测试 区，其优选通过内部区域在空间上与另一个测试区分开。限定的测试 区优选具有10pm至lcm的直径，特别优选lO^im至5mm。最优选 具有l〇Hm至2mm直径的小型化测试区。优选具有几个测试区的固 相，也将其称为矩阵系统。这样的矩阵系统，例如描述于Ekins和Chu (Clin.Chem.37, 1995, 1955-1967 )和 U.S.专利 no.5,432,099、5,516,635 和5，126,276中。如之前所提及的，矩阵系统的优势是可以对一个样 品同时进行几种分析物和对照测定。检测非特异性结合和/或千扰样品 的对照区的使用可以显著提高结果的可靠性，尤其是使用小型化矩阵 测试系统。

在本发明中，通过使用这样的基于矩阵的测试系统，例如可以同

时进行TIMP-1、A2M和铁蛋白以及可能的其它生化参数的检测。

根据本发明，固相是用于检测方法的任何常规支持物，优选无孔 支持物，例如，具有塑料、玻璃、金属或金属氧化表面的支持物。有 孔支持物如测试条带也是合适的。空间上分开的区域（测试区）位于 该支持物上。将固定于固相的受体施加至这些测试区。通过已知的方 法来固定固相受体，例如通过直接的吸收性结合，通过共价结合或通 过高亲和性对的结合，例如抗生蛋白链菌素（或抗生物素蛋白）/生物 素、抗原/抗体或糖/凝集素。可以通过例如待测定的分析物或分析物 类似物的检测介质的成分与固相受体的特异性结合来测定样品中分析 物的存在或/和含量。

在根据本发明的方法中通过使用合适的标记基团例如荧光标记基 团以已知的方式来实现分析物的检测和•合适的情况中-干扰反应存在 的检测。或者，例如通过等离子体共振光谱测定相应区域的层厚度， 使用合适的固相也可以检测检测介质的成分与测试区和任意的对照区 的相互作用。

使用其中同时检测样品几种分析物的矩阵系统，优选将能够同时 检测几种不同分析物的通用标记基团运用至不同的测试区。这样通用 标记基团的实例是携带受体的标记基团，该受体可以与测试试剂上的 互补受体特异性地相互作用，例如，用于待测定分析物或用于分析物 类似物的可溶性受体（如抗体/抗原或抗生蛋白链菌素/生物素等）。

术语样品意思是含有或假设含有至少一种根据本发明标记的生物 标本。例如可以使用血样、血清、尿液、唾液、滑液或肝脏组织。如 果需要，在分析前可以将流体样品进行稀释。

为了获得有助于诊断疾病的结果，使用本领域技术人员已知的算 术算法。合并获得的数据并通过统计学方法如逻辑斯蒂二元回归来评 价，获得评分。

图1显示了对120名遭受HCV感染的患者测量的原始数据。

通过以下的实施例来进一步说明本发明：

实施例

使用可购得的测试试剂盒并根据如下所列的制造商提供的说明来

成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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