血清自发荧光对肝纤维化诊断价值的 探讨与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法
血清自发荧光对肝纤维化诊断价值的 探讨与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法
摘要：目的成都华西华科研究所研究研究大鼠肝纤维化不同阶段血清自发荧光强度。方法SD大鼠54只随机分为正常对照组和肝 纤维化模型组,应用四氯化碳皮下注射法制备大鼠肝纤维化模型，分别检测大鼠血清Ex337/Em512、Ex337/Em450 和Ex370/Em440 ran处自发荧光强度,并进行肝脏组织病理学检查，对肝纤维化程度进行评分。结果模型组肝组 织3处纤维化评分均高于正常对照组(P均<0.01)。肝纤维化大鼠8、12周3个波长下血清自发荧光强度均高于 正常对照组(P均<〇. 〇1),且随肝纤维化严重程度加重而逐渐增强，但4周比较无统计学差异（P >0.05)。结论 肝纤维化大鼠血清自发荧光强度增强，血清自发荧光检测一定程度上可反映肝纤维化严重程度。
关键词：自发荧光;肝纤维化;诊断
肝纤维化大鼠血清晚期糖基化终末产物 (AGEs)升高，根据 AGEs 具有在 Ex370/Em440 nm 处有自发荧光的特点[1]，推测Ex370/Em440 nm处 的肝纤维化大鼠血清自发荧光是增强的。2008年3 ~6月，我们在预实验中试用337 nm为激发光激发 肝纤维化大鼠的肝组织匀浆,发现在512、450 nm处 有自发荧光，但是肝纤维化肝组织中的自发荧光能 否通过血清反映出来尚不明确。本实验旨在研究大 鼠肝纤维化形成过程中3个波长处（Ex337/Em512、 * *
强度。
1材料与方法
1.1实验动物及主要试剂清洁级SD健康雄性 大鼠54只，体质量（200 ±20)g，购自并饲养于首都 医科大学实验动物中心。橄_及四氯化碳 (CC14)购自北京化学试剂公司。
1.2模型制备及标本处理大鼠随机被分成:正常 对照组:24只，皮下注射橄榄油3 ml/kg，每周2次。 CC14模型组:30只，皮下注射体积分数40%的CC14 橄榄油溶液3 ml/kg，每周2次。实验过程中两组动 物均给予纯净水自由饮用。各组均于第4、8、12周
末随机麻醉处死1/3数量大鼠，留取血清-20 T保 存。留取部分肝组织以等渗盐水冲洗，用体积分数 10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，Van Gieson 染色，进行纤维增生程度评分。
1.3血清自发荧光检测应用日本岛津RF-5000 型荧光分光光度计，激发光狭缝宽度为5 mn，发射 光狭缝宽度为5 run,取血清0. 5 ml与双蒸水1: 5比 例缓慢注人3.0 ml石英比色杯中，检测3个波长处 血清自发荧光强度。所有样品重复测量3次，所有 操作均在室温下进行。
1.4光镜下肝组织纤维化分级光镜下观察VG染色 肝组织切片，根据其纤维增生程度分为〇 ~4级[2]。
1.5统计学方法采用SPSS 12. 0统计软件进行 试验数据分析，计量资料x ± s表示，组间比较采用* 检验。以P矣0.05为有统计学差异。
2结果
2.1病理学检测结果正常组肝脏肝板以中央 静脉为中心呈条索状，向四周放射样排列，板间有 不规则肝窦，肝小叶内网状纤维支架完整，分布规 律，无胶原纤维存在。实验第4周，0(：14模型组主 要表现为肝细胞脂肪变性、坏死，纤维结缔组织只 限于中央静脉周围，有向小叶发展倾向。实验第8 周，肝细胞脂肪变性、坏死，纤维结缔组织增生，由 中央静脉向汇管区发展，部分结缔组织进入肝小 叶达汇管区周围；实验第12周，纤维结缔组织弥 漫增生，纤维间隔增宽伴假小叶形成。肝组织纤 维化程度分级评分比较见表1，可见CC14模型组 大鼠4、8、12周肝纤维化评分均明显高于正常对 照组（P均<〇.〇1)。
表1各组大鼠的肝纤维化分级评分比较
|
组别 |
n |
0 |
肝纤维化分级 1 2 3 |
4 |
纤维化分级 评分 |
||
|
正常对照组 |
|||||||
|
4周 8周 |
8 |
8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0.00±0.00 |
|
8 |
8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0.00±0.00 |
|
|
12周 |
8 |
8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0.00±0.00 |
|
CC14模型组 |
|||||||
|
4周 |
10 |
0 |
9 |
1 |
0 |
0 |
1.10±0.32* |
|
8周 |
10 |
0 |
0 |
6 |
3 |
1 |
2.20 ±0.42* |
|
12周 |
10 |
0 |
0 |
0 |
2 |
8 |
3.70 ±0.48* |
表2各组大鼠血清自发荧光强度比较
组别
正常对照组 4周 8周 12周
CC14模型组 4周 8周 12周
n 337/512 nm 337/450 nm 370/440 nm
8 115.57 ± 21.01 65.34 ±10.04 64.36±12.52
8 159.23 ±19.52 78.63 ±12.80 77.49 ±9.37
8 207.85 ± 31.06 97.16 ±10,77 133.16 ±29.90
10 146.05 ± 38.26 73.74 ±15.93 77.78 ±17.86
10 207.39 ±28.88* 101.54 ±15.84* 103.38 ± 19.80* 10 368.68± 78.84* 177.20 ± 34.92 * 281.32 ±64.42*
注：与正常对照组比较，/3 < 〇. 01
3讨论
自体突光是指不用外源性荧光物质，生物组织在 光激发下产生的荧光。在适当波长的紫外光激发下 血清中许多蛋白质及非蛋白质分子均能产生自发荧 光[3]。近年来多项研究已证实，利用病变组织或体液 的特异性荧光进行疾病的诊断[4]，尤其是肿瘤的诊 断。李渊等~对经胃镜、病理确诊的202例各种胃内 疾病患者(包括34例进展期胃癌和1例早期胃癌）的 胃液稀释后进行了固有荧光光谱分析,发现胃癌患者 胃液与良性胃病患者胃液荧光强度存在明显差异。 提示胃液的荧光测定有助于胃癌的诊断。我们在预 实验的基础上研究了大鼠肝纤维化形成过程中血清 自发荧光强度，发现肝纤维化大鼠血清自发荧光强度 明显增强,且随肝纤维化严重程度而逐渐增强。提示 血清自发荧光检测一定程度上可反映肝纤维化严重 程度。但应用CC14 4周末模型组血清自发荧光强度 与对照组相比无明显差别，提示血清自发荧光强度对 非显著性肝纤维化可能价值有限。
目前肝纤维化血清自发荧光的物质基础尚不明 确。现在认为肝纤维化的形成是由于各种损肝因子 引起肝细胞损伤、坏死、凋亡及肝组织炎症反应，激 活枯否细胞分泌多种细胞因子，与肝细胞、血小板及 窦内皮细胞分泌的细胞因子、脂质过氧化物等化学 递质，通过旁分泌或自分泌机制，共同作用于肝星状 细胞，使之激活并转变为肌成纤维细胞，从而合成大 量的胶原和蛋白多糖等细胞外基质。这一过程可引 起血清细胞外基质、胶原酶类及细胞因子等某些物 质含量增加。其中有些物质有可能产生特定荧光， 从而使血清自发荧光强度随肝纤维化严重程度加重
注:与正常对照组同一时间比较/P<0.01
2.2血清自发荧光强度 CC14组大鼠血清在 337/512、337/450和370/440 nm处自发荧光强度 与正常组比较在肝纤维化4周无统计学差异（/> >
1. 05)，在肝纤维化8周和12周均有统计学差异 (P均< 0• 01)，且随肝纤维化分级进展逐步增强， 见表2。
而增强。AGEs是指蛋白质、核酸或脂质等大分子 物质的氨基在不需酶参与的条件下，能自发的与葡 萄糖或其他还原糖的酸基或酮基反应所生成的稳定 的共价加成物。国外研究证实，肝硬化患者血清 AGEs水平明显升高，并被认为是肝硬化的血清学 指标[6’7]。AGEs具有自发荧光的特性，在370 mn/ 440 rnn产生特定的荧光。据此推测本实验中370
nm/440 nm处产生自发焚光的物质有可能是AGEs。 Anderson等[8]用332 nm激发光对鲭鱼和大麻哈鱼 肌肉、胶原固有荧光光谱特征进行了观察，发现I、 IV型胶原组织固有荧光光谱峰分别位于390、430、 480 nm处。据报道，血清中胆红素的激发峰为460 nm,发射峰值为515 nm，推测 Ex337/Em512、Ex337/ Em450 mn处自发荧光物质有可能不是I、IV型胶 原和胆红素[9]。关于肝纤维化血清自发荧光物质 基础仍有待于进一步研究。
成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪
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