血清miR-132和miR-212表达在肝硬化检测中的意义与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法
血清miR-132和miR-212表达在肝硬化检测中的意义与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法
摘要：目的研究血清miR-132和miR-212表达在肝硬化检测中的意义。方法随机选择63例不同阶段的肝硬化患 者，参照63例健康人血样，同步使用PCR检测法进行肝功能检测和miR-132和miR-212表达检测，对比相应结果。结果 肝硬化患者的肝功能检测结果与健康人士有明显差别，肝硬化患者的miR-132和miR-212表达显著降低，与内参照U6比 值分别达到了 0.43±0.22和0.73±0.48。结论肝硬化患者的miR-132和miR-212表达会出现显著降低。
关键词：miR-132;miR-212;肝硬化;表达
Selmi C最初发现原发性胆汁性肝硬化患者血 清中miR-132和miR-212的表达均有变化，miR- 132 与 miR-212 在血清中 的表达与免疫力相关【1]。 故近5年多项研究均将miR-132与miR-212的靶 向作用进行研究,miR-132已被确认为血管再生开 关因子，miR-212已被确认为细胞有丝分裂开关因 子。此二者对肝硬化的修复过程均具有现实意义 [2,31。肝硬化患者的tniR-132和miR-212的表达均 有降低，检测血清miR-132和miR-212对肝硬化 的诊断具有积极意义。
1资料与方法
1.1 一般资料选择2011年4月至2014年4月 来我院参与肝硬化治疗的患者63例，其中男性42 例，女性21例，年龄32~67岁，平均年龄45±1.2 岁。所有患者均为龙门地区汉族人群。患者合并腹 膜炎的33例，肠系膜炎32例，门静脉高压患者41 例，淤血性脾大患者39例，腹水患者17例。全部 患者有饮酒史，日均饮酒50ml以上的21例。所有 患者中，代偿期肝硬化22例，失代偿期肝硬化患 者41例。见表1。
1.2标本采集方法采用一次性真空采血管采集 患者空腹静脉血5ml。置于离心机中，使用10000r/ min转速离心10min。取上清液(血清)置于保 存。
1.3 RNA提取方法取样本血液lml,置于离心机 中10000r/min离心处理1.5min。取血清200|xl加 入20〇MJTriz〇l裂解剂，充分震荡，提取总RNA。
1.4 PCR反应及miRNA逆转录方法提取的RNA
作者简介:王永良，1970年3月出生，主管技师；大专学历，主要研 究方向为临床生物化学及微生物学。
表1患者一般资料表
|
分组 |
n |
代偿期 |
失代偿期 |
肝外炎症 |
腹水 |
|
例数 |
|
22 |
41 |
40 |
17 |
|
35 岁以 T1114 |
6 |
1 |
5 |
5 |
1 |
|
女性 |
2 |
1 |
1 |
1 |
0 |
|
男性 |
12 |
5 |
7 |
6 |
2 |
|
35〜39岁 |
|||||
|
女性 |
6 |
3 |
3 |
3 |
1 |
|
男性 |
14 |
7 |
7 |
7 |
5 |
|
40~50 岁 |
|||||
|
女性 |
7 |
2 |
5 |
5 |
3 |
|
男性 |
10 |
2 |
8 |
8 |
3 |
|
50岁以上 |
|||||
|
女性 X2 P |
6 |
1 0.0053 |
5 5 0.0042 0.0052 P>0.05 |
2 0.0049 |
|
注:本文以以上肝硬化患者为研究组，选择另外63例自愿参与 实验的健康人作为参照组进行研究。
溶解于 11 |xl DEPC-treated water,加人 l|xl Oligo (dT)18 primer (0.5|xg/(JLl)轻微震荡后离心 3~5s,在 PCR扩增仪上70T； 5min。冰上冷却，并短暂离心， 向反应体系 *W〈5xreactionbuffer4(xl,Ribolock； ™ Ribonuclease inhibitor(20U/lxl) l|xl,10 mM dNTP mix2|jLl。轻微震荡后离心3~5s，在PCR扩增仪上 37丈5min。向反应体系中加入1^611人;(1™]^- MuLV Reverse Transcriptase (200U/|xl) 在 PCR 扩增仪上10min。引物设计使用 广州锐博公司的标准序列。退火温度为60丈，产物 片段106bp,以U6标准作为内参考[41。
1.5生化分析方法备份血液样品进行GGT、ALP、 ALT及TBil等肝功能项目检测，使用生化分析仪 及配套试剂完成所有操作均按说明书严格操 作，因此操作过程与本文实质研究结果并无直接 关系，在此不做赘述。
1.6统计学方法用SPSS 19.0统计软件进行。计
.164-
实验与检验医学 2015 年 4 月第 33 卷第 2 期 Experimental and Laboratory Medicine, Apr.2015,Vol.33,No.2
量资料用表示；多组间数据的比较采用单因素 方差分析，多组数据两两间的比较采用LSD-t检 验，两变量之间关系采用Pearson相关性分析;以 P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1生化及临床检测结果在总胆红素(TBil)、直接 胆红素(D Bil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨 酸氨基转移酶丨AST)、碱性磷酸酶丨人1^和7-谷氨酰 基转移酶(GGT)等指标中，研究组均与实验组具有 明显差异，特别是代表肝脏损伤的ALP和GGT指 标，研究组明显高于健康组。胆碱脂酶(CHE)C反应 蛋白(CRP)血沉(ESR)两组患者基本相似。见表2。
表2各组对象生化及临床指标对比表
|
参数 |
研究组 |
健康组 |
F |
P |
|
TBil(fJLmol/L) |
46.4±13.8 |
16.6 士 53 |
8.7 |
0.012 |
|
DBil(|JLmol/L) |
24.9±9.8 |
4.3±2.6 |
10.6 |
0.001 |
|
ALT(U/L) |
66.3 士 12.7 |
30.7±4.6 |
9.8 |
0.003 |
|
AST(U/L) |
81.2±26.7 |
36.2 土 6.2 |
8.8 |
0.031 |
|
ALP(U/L) |
332.1 士 123.5 |
77.3±16.5 |
22.2 |
0.029 |
|
GGT(U/L) |
102.9±18.9 |
23.4±7.8 |
36.4 |
0.017 |
|
CHE(KU/L) |
6.8±4.1 |
7.3 土 4.0 |
4.8 |
0.124 |
|
CRP(mg/L) |
4.1 士 2.1 |
4.6 士 1.6 |
5.3 |
0.063 |
|
ESR(mm/h) |
14.2±8.9 |
13.7±7.8 |
5.1 |
0.057 |
2.2 miR-132和miR-212的表达水平两组患者 的miR-132和miR-212的表达水平均有所降低，特 别是miR-132降低幅度较大。而部分患者的miR- 212 7K 平出现了升高 ，但此部分患者占肝硬化患者的 一小部分。也就是说，肝硬化患者的miR-132和 miR-212均出现了波动，miR-132以下降为主，下降 幅度在50%以上，而miR-212除极少部分偏高外，绝 大部分都出现了一定程度的下降。见表3。
表3各组研究对象血清miR-132和miR-212的表达水
平对比(JC±S)
|
分组 |
miH-132/U6 |
miR-212/U6 |
|
研究组 |
0.43±0.22 |
0.73 士 0.48 |
|
健康组 |
1.00±0.13 |
1.00 士 0.16 |
|
F |
33.5 |
24.2 |
|
P |
0.014 |
0.003 |
3讨论
目前普遍认为miR-132是血管生长的刺激因 子，miR-132升高时，血管的修复能力增加，毛细血 管更加发育。而当miR-132下降时，机体的自我修 复能力表现低迷，机体愈合能力降低。miR-132无 疑为肌体特别是血管修复的“开关因子”。miR-212 因子是刺激细胞分裂的因子，当miR-212因子升
高时，细胞分裂更加活跃，而当miR-212因子降低 时，细胞分裂活动比较缓慢。事实上，目前的癌症 信息素治疗方案中，有效地抑制miR-132和miR- 212 因子，可以有效地调节癌症发生和恶化的概 率。而肝硬化患者体内的miR-132降低抑制了肝 脏的自我修复，而miR-212的波动，引起了肝脏内 局部异常增生或者同步造成了肝脏的自我修复能 力降低。
Selmi C等m对肝硬化的免疫功能改变进行了 研究，特别研究了肝硬化患者手术康复期的免疫 能力变化。肝硬化患者的免疫力在本文研究中出 现了普遍下降，比非肝硬化组出现炎性症状的概 率明显升高。Dai !1等[9】研究了自身免疫对于源发 胆汁肝硬化的病理作用。原发性胆汁性肝硬化是 导致miR-212升高的主要原因，在原发性胆汁性 肝硬化条件下，miR-132下降幅度更加明显，而 miR-212更倾向于发生升高的变化。Murata K等[1°] 研究了风湿性关节炎和骨膜炎患者的rmR-132和 miR-212表达。miR-132’与miR-212在风湿性关 节炎和骨膜炎患者血清中的表达与肝硬化类似， 此两类患者的miR-132和miR-212表达均出现了 较明显的下降，且miR212降低的幅度大于肝硬化 患者。Wei X等M研究了病毒性肝癌患者的miR- 132 和 miR-212 表达。本文研究同步发现，肝硬化 患者的miR-132和miR-212表达会出现显著变 化,miR212出现下降而miR-132在肝硬化体质的 基础上出现升高。这与肝硬化患者的免疫力下降 是问步的。
Heathcote EJ等M对肝脏疾病进行了统观性的 研究。徐芸等及陈燕等对肝硬化患者的相关体征 检查数据进行了汇总，并且做出了统观性研究 [13，14]〇从某种意义上，miR-132和miR-212表达是 肝硬化患者的一个体质特征，本文虽然没有对 miR-132和miR-212表达于肝硬化的形成产生明 显的相关性结论，但足以证明miR-132和miR- 212 表达与肝硬化体质具有直接的关系。
成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪
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