吲哚氰绿排泄试验在不同程度 肝纤维化检测中的应用与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

摘要：目的成都华西华科研究所研究通过吲哚氰绿（ICG)排泄试验检测肝脏纤维化指标和INF-丫综合推断肝脏纤维化程度。

方法选择2012年1月至2013年10月医院诊断为肝纤维化肝硬化的患者129例为试验 组，正常体检健康者19例为对照组，检测肝纤维化指标和INF-y，同时对试验组进行肝组织活检而确 定肝纤维化程度，利用ICG排泄试验检测试验组的K值和R15。运用SPSS 17.0软件对数据进行统计分 析。结果K值和R15在五个纤维化程度（S^   S₂、S₃、S₄)不同的病理类型中有显著差异；肝纤维

化指标在S_D、S,、S₂、^组中有显著差异，在S₄组和S₃组中无显著差异性。结论吲哚氰绿排泄试验可 能成为推断肝纤维化程度的新指标和方法。

关键词：ICG排泄试验；肝硬化；检测

肝脏储备功能是肝切除术前必要的检测项目。 肝脏储备功能是否可以达到手术的标准意味着术 中肝功能的耐受状况以及术后并发症发生率的高 低^[1]。肝切除术前准确地判断肝纤维化程度是提 高围手术期安全的重要因素^[2]。由乙型肝炎病毒 (HBV)感染引起的肝纤维化是我国肝硬化发生的 主要原因^[3]。肝纤维化诊断的金标准是病理活组织 检查，但活组织检查是有创性检查，难以广泛开展 及推广普及^[4]。肝纤维化的无创性检测主要为患者

血液中肝纤维化指标的检测，间接反映肝脏纤维化 的程度。Yamasaki等^[5]发现肝纤维化指标和不同病 理分期的肝纤维化具有一定的相关性。Torruellas 等^[6]利用血清中血清铁蛋白合并肝纤维化指标推测 肝脏的纤维化程度以及与Child-Pugh分级肝功能储 备的关系，发现两者存在一定的相关性。然而，由 于肝脏的代偿功能较强，单纯利用生化指标推测其 肝纤维化可能存在误差。吲哚氰绿（ICG)排泄试 验作为肝功能储备的检测手段之一，比Child-Pugh 分级更具有客观性，ICG的排泄和肝细胞的吸收滤 过功能有关^[7]。^[8]利用大鼠肝脏纤维化模

型检测ICG排泄率和生长转化因子（肝纤维化指 标）的mRNA和蛋白质水平呈显著的负相关，证明 吲哚氰绿的排泄率可能与肝纤维化有一定关联。然 而，对于不同程度的肝纤维化（包括肝硬化）之间 的肝功能储备的临床资料报道较少。仅生物化学指 标的检测可能会由于肝功能较强的代偿性而缺乏可 比性^[9]。因此，本课题组利用不同程度的肝纤维化 患者血清内的INF-丫、生长转化因子、肝纤维化指 标和吲哚氰绿排泄率，综合评价这几个指标在推测 不同程度肝纤维化的效果，以期推测ICG试验结果 与不同肝纤维化肝硬化程度的关系，为检测肝纤维 化程度提供新的无创性的敏感指标。

1材料与方法

1.1临床资料本课题组选取2012年1月至2013年10 月第三军医大学西南医院诊断为肝纤维化合并HBV 感染的病例129例，病例选择符合2010年版《慢性 乙型肝炎防治指南》^[1°^]标准，排除有心血管病、 肾功能失常、凝血功能严重障碍的病例。129例患 者中男103例，女26例，年龄10〜78岁，平均年 龄（46.78 ± 12.93)岁，慢性肝炎轻度（CH- I ) 28例，中度肝炎（CH-II) 37例，重度肝炎（CH- III) 27例，肝硬化（LC) 37例。同时，以19例健 康体检员作为对照组（NC),男7例，女12例，平 均年龄（34.19 ±9.35)岁。本研究符合赫尔辛基宣 言，通过医院伦理委员会审核，得到所有受试者的 书面同意书。

1.2生物化学指标检测取试验组和对照组人员的 清晨空腹5 ml血液（全血）进行检测。INF-y采用 双抗体夹心ELISA法检测，试剂由上海皓嘉生物试 剂有限公司提供。其流程是：①将1包被缓冲液稀 释抗体浓度1〜10 Hg/L,在酶标板中加入0.1 ml,

4 °C过夜；②在酶标板中加0.1 ml的待检血液（同时 做空白对照，阴性对照和阳性对照），置于湿盒中 37 °C, 1小时；③加入酶标抗体0.1 ml，37 °C, 1小 时；④加入MTB底物显色0.1 ml, 37 °C, 1小时；⑤ 各反应孔加入终止液0.05 ml;⑥将酶标板放在酶标 仪上进行读数；⑦根据公式计算出试验孔中浓度的 数值。肝纤维化指标[血清透明质酸（HA)、层粘 连蛋白（LN)、前III胶原（PCIII)]检测试剂盒由大 连宝生物有限公司提供。具体方法是：①依次加入 0.1 ml被测血液（标准品）、0.1 ml抗血清和0.2 ml标 记物；②孵育4 °C, 24小时；③加入活性炭300汕离 心，取沉淀物测CPM数。

1.3肝活组织检查利用美国产Au4型彩色多普勒 机作为引导，使用配套活检枪（AlokaSSD-1700)

对试验组进行穿刺，对照组人员不作肝组织活检。

肝组织标本采用HE染色，由病理专科医师按肝 组织病理诊断标准做出肝组织病理分级分期诊断 (METAVIR计分系统标准）^[11]。

1.4 ICG排泄试验取患者空腹外周静脉血测定Hb 值，将检测者的身高、体重等指标输入DDG分析仪 (DDG-2001，上海博取仪有限公司）。按0.5mg/kg 计算ICG给药量。将配制好的ICG溶液在10秒内从一 侧肘正中静脉均勻注入，系统测出ICG血浆清除率 (K值）和ICG15分钟滞留率（R15)。对照组不进 行该试验。

1.5统计学分析利用SPSS 17.0软件进行不同组别 的单因素方差分析并利用Graphpad 5.0软件进行线 性相关性分析。以P < 〇.〇5为差异有统计学意义。

2结果

2.1 血清中INF-丫、HA、LN、PCIII、K值和R15与临 床类型间的关系经多组间分析，INF-y在CH-III和

LC组中无显著差异（P= 1.0),而在其他组间差 异均有显著统计学意义（P < 〇.〇1)。HA在CH- I 和CH-II组中无显著差异（尸=1.0)，而在其他组 间的差异有显著统计学意义（P < 0.01)。LN在 CH-I和CH-II组间无显著差异（尸=0.440),而 在其他组间差异有显著统计学意义（P < 0.01)。 PCIII在CH- I和CH-II组中无统计学差异（P = 1),在其他组间差异有显著统计学意义（P < 0.01)。K值在CH-I和CH-II组中未表现出明显差 异（P = 0.238)，在CH-II和CH-III组中无统计学差 异= 0.754),在其他组间差异有显著统计学意 义（尸<0.01)。R15在各个类型组中差异均有显著 统计学意义（户<〇.〇1)。上述组别HA、LN、PCIII 与对照组相比，均显著升高（尸<〇.〇1)，见表1。 2.2肝组织不同纤维化分期与血清中INF-丫、HA、 LN、PCIII、K值与R15的关系INF-i^S₂组和8₃组 中无统计学差异（P = 0.621 )，在其他组间差异有 显著统计学意义（户< 〇.〇1)。HA在S。组和8,组 (尸=1.0) , 8₂组和8₃组（尸=1.0) , S,组和8₂组 (P = 0.34)间差异无统计学意义，在其他组间差 异有统计学意义[S。组和S₂组（P = 0.078)，S,组和 台₃组（P = 0.037)，其余组间（尸<0•0〇], LN 在S。组和Si组间无统计学差异（P = 0.89),在其余 组间差异有显著统计学意义（P<〇.〇l)。PCIII在 S。组和S,组间无统计学差异（户=1.0)，在其余组 间差异有显著统计学意义（P < 〇_〇1) » K值在S₀ 组和S,组和8₂组，S₃组和S₄组中均无统计学差 异（P= 1.0)，在其余组间差异有显著统计学意义

CP< 0.01)。R值在S₀组和CP = 0.215)，S₃ 组和S₄组（尸= 0.698)均无统计学差异，在其余组 间差异有显著统计学意义（P< 0.01)。

2.3 K值和R15与肝纤维化指标间在病理分期中 的相关性由图1A可以看出，K值和肝纤维化指 标呈负相关，与PC-III相关度最高（/> = 0.014, 一 =0.9221),与 LN 相关度最低（P = 0.035, ^=0.7799);由图1B可以看出，R15和肝纤维化 指标（PC-III、LN、HA无明显相关性（P值分别 为 0_673、0.725、0.370。

表1血清中丫-INF、HA、LN、PCIII、K值和R15与临床类型间的关系

临床类型	INF-丫（ ng/L)	95%CI	HA (pg/L)	95%CI	LN (pg/L)	95%CI
CH- I	1.266 ±0.015	1.260, 1.272	50.18 ±2_80	47.09, 51.27	98.34 ±4.63	98.5, 100.1
CH- II	1.186 士 0.088	1.153, 1.218	50.90 土 0.53	50.69, 51.11	101.0 ± 1.22	100.5, 101.5
CH- III	0.994 ± 0.065	0.966, 1.022	104.50 ±6.50	98.75, 110.3	188.2 土 9.12	184.4, 192.0
LC	1.003 ±0.060	0.9771, 1.028	80.35 土 11.52	77.78, 82.93	150.2 士 7.29	146.6, 153.9
NC	0.942 ± 0.038	0.873，1.173	38.93 ± 0.07	27.98, 41.91	95.8 ±0.05	93.1, 101.0
临床类型	PC- III (只g/L)	95%CI	K值	95%CI	R15 (%)	95%CI
CH- I	143.1 ±5.7	140.8, 145.3	0.21 ±0.01	1.20，1.21	11.41 ±0.86	11.08, 11.75
CH- II	142.7 ±3.5	141.6, 143.9	0.15 ±0.02	0.14, 0.15	15.91 ±2.44	14.99, 16.83
CH- III	204.5 士 14.0	198.1, 210.9	0.39 ±0.01	0.28，0.50	59.95 ±2.19	56.72, 63.17
LC	175.5 ±11.9	169.9, 181.0	o.io 士 cm	0.10, 0.10	30.42 ±6.21	29.55, 31.2B
NC	94.9 ±0.1	90.8, 98.8	-	-	-	-

注：CH- I:慢性轻度肝炎，CH-II:慢性中度肝炎，01-111:_慢性重度肝炎，LC:肝硬化，NC:健康对照组

CH-I 组与CH-II组相比，INF-Y: P = 0.0087; HA:尸=1.0，LN:尸= 0.440; PCIII:尸=1.0; K值：尸= 0.238; R15:尸= 0.0090。CH-I 组和CH-ffl组相比，INF-Y:尸= 0.0025; HA:尸= 0.0039; LN:尸= 0.0040;尸CIII: P = 0.0064; K值：戶=0.0068; R15:

尸= 0.0057。CH-I 组和LC组相比，INF-Y:尸= 0.0027; HA:尸= 0.0059; LN:尸= 0.0065;尸CIII:尸= 0.0082; K值：尸= 0.0079; R15:尸= 0.0074。CH-I 组和NC组相比，INF-Y:尸= 0.0018; HA:尸= 0.0082; LN:尸=0.0094; PCIII:尸= 0,0073。CH-II和CH-III 相比，INF-Y:尸= 0.0035; HA:尸= 0.0041; LN:尸= 0.0042; PCIII:尸=0,0063: K值：尸= 0.754; R15:尸=0.0050。CH-II和LC相 比INF-Y: P = 0.0047_; HA:尸= 0.0062; LN:尸= 0.0068;尸CIII: P = 0.0082; K值：尸= 0.0087; R15:尸=0.0074。CH-II和NC相比， INF-尸= 0.0031; HA:尸= 0.0079: LN:尸= 0.0091; PCIII:尸=0.0075。CH-III和NC相比，INF-Y:尸=0.0061; HA:尸= 0.0027; LN:尸= 0.0031; PCIII:尸= 0.0039。CH-III和LC相比，HA:尸= 0.0067; LN:尸= 0.0091;凡冚：尸= 0.0087; K值：尸= 0.0049; R15:尸= 0.0069。LC和NC相比，INF-Y:尸= 0.0072; HA:尸= 0.0050; LN:尸=0.0058; PCIII:尸= 0.0056

表示无相关数据

2.4 K值和R15与INF-"/的相关性检测由图2A可以看 出，K值与INF-y含量呈显著正相关（r² = 0.8360，

尸= 0.028),由图2B可以看出，R15与INF-y含量 呈显著负相关（r² = 0.9000, P = 0.031)。

2.5肝纤维化指标与INF-y的相关性检测由图3可 以看出，INF-丫 与 HA <y = 0.9012,尸=0.013，） 和LN (— = 0.9180,戶=0.046)呈显著负相关，与 PC III无相关性（P = 0.068)。

3讨论

肝纤维化的诊断一直都是国内外学者研究的热

表2肝组织不同纤维化分期与血清中INF-丫、HA、LN、PCIII、K值和R15的关系G±s)

病理分期	INF-7 (ng/L)	95%CI	HA (yig/L)	95%CI	LN (^g/L)	95%CI
S〇	1.248 ±0.061	1.184, 1.313	92.97 ± 11.38	86.9，99.1	123.0 ±7.5	118.2, 127.8
S,	1.194 土 0.096	1.139, 1.249	131.7 ±30.42	125.9, 137.5	130.4 ±14.7	124.3，136.4
S2	1.078 ±0.112	1.026, 1.131	269.5 ±50.91	251.9, 287.1	148.9 ± 18.0	144.8, 152.9
S3	0.957 土 0.061	0.924, 0.991	604,3 士 11.38	561.3, 647.2	246.7 ±7.5	236.6, 256.9
S4	0.873 土 0.080	-	537.26 ± 103.49	-	239.9 士 20.8	-
病理分期	PC- III ( ng/L)	95%CI	K值	95%CI	R15 (%)	95%CI
S〇	106.1 土 12.4	98.92, 113.3	0.21 ±0.23	0.179, 0.244	6.096 ±6.299	5.804, 6.388
S,	154.5 士 9.0	149.1, 160.0	0.19 ±〇.〇2	0.179, 0.191	9.616±3.156	9.172, 10.06
S2	185.0 ± 18.2	179.7，190.4	0.54 ±0.13	0.428，0.644	10.60 ±6.98	10.11，U.10
S3	209.5 士 12.4	200.0, 219.0	0.06 ±0.23	0.058，0.064	29.60 ± 6.30	27.87, 31.34
S4	208.1 ±19.6	-	0.025 ± 0.003	-	59.47 ± 10.46	-

注：SO 组和 S1 组相比，INF-y:尸= 0.0087; HA:尸=1.0，LN:尸= 0.89; PC III:尸=1.0; K 值：尸=1.0; R15:尸= 0.215。SO 组和 S2 组相比，INF-Y:尸= 0.0067; HA:尸=0.078，LN:尸=0.0073; PC III:尸= 0.0046; K 值：尸= 0.0068; R15:尸= 0.0057。SO 组 和 S3 组相比，INF-Y:戶= 0.0062; HA:尸=0.0065，LN:尸= 0.0036; K： III:尸= 0,0081; K 值：尸= 0.0075; R15: P = 0.0033。S0 组 和 S4 组相比，INF-Y:尸=〇_〇〇32; HA:尸= 0.0074，LN:尸=0.0033; PC III:         0.0079; K 值：尸= 0.0043; R15:尸= 0.0029。S1 组

和 S2 组相比，INF-Y:尸= 0.0075; HA:尸= 0.34，LN:尸= 0.0069; PC III:尸= 0.0036: K 值：尸=1.0; R15:尸=0.0073。S1 组和 S3 组相比，INF-Y:尸= 0.0049; HA: P = 0.037，LN:尸= 0.0052;凡111_:尸= 0.0062: K 值：尸= 0.0071; R15:尸= 0.0061。S1 组和 S4 组 相比，INF-Y:尸= 0.0044; HA:尸=0.0086, LN:尸= 0.0049; PCIII:尸= 0.0028: K 值：尸= 0.0069; R15: P = 0.0049。S2 组和 S3 组 相比，INF-y:尸= 0.621; HA: P=1.0, LN:尸= 0.0041; PCIII:尸= 0.0035; 1C 值：尸= 0.0046; R15:尸= 0.0072。S2 组和 S4 组相比， 1>^-丫_：尸=0.0056_;11八_：尸=0.0059，1^:尸=0.0047_;尸(：111_:尸=0.0051_;1<：值_：尸=0_0042_;1115_:尸=0.0059。83组和34组相比， INF-Y:尸= 0.0081; HA:尸= 0,0065, LN:尸= 0.0092;尸C III:尸= 0.0055; K 值：尸=1.0; R15:尸= 0.698 表示无相关数据 ■

——HA ...LN

——pc-ni

1.0    1.1    1-2   1.3    1.4

y-INF(ng^)

图3 INF-y与肝纤维化指标的线性关系

点^[12]。肝纤维化是慢性肝病发展的病理过程，肝小 叶的破坏及重建形成假小叶后进入肝硬化阶段，故测 定肝纤维化的程度，可以评估肝脏损伤的程度^[13]， 其诊断金标准是病理活组织检查，然而该方法是有 创性的且可能存在并发症及误差^[14]，患者难以接受， 亦不宜用于随访和疗效观察。无创性的方法主要集 中在血清肝纤维化标记物的生物化学指标检测上， 肝纤维化后的降解成分可以间接反映出肝纤维化程 度^[15]，但是由于影响胶原纤维降解的因素较多，单 纯依赖于生物化学指标的检测不足以诊断出肝纤维

化程度其他针对肝纤维化的影像学检查主要有 MRI、CT和超声等，这些检查大多在肝纤维化晚期, 发生肝硬化和门静脉高压时才易诊断。INF-丫是目 前较有效的抗纤维化药物，其主要来源于肝细胞， INF-y可以介导TNF-a加重对肝细胞的损伤。HA 与该指标具有负相关性，表明INF-y可以阻碍肝纤 维化进程^[17]。

吲哚氰绿排泄试验是近年来运用比较广泛的肝 功能储备检测技术，相较于传统Child-Pugh分级所 存在的主观性偏差因素，吲哚氰绿排泄试验更具有 检测肝储备功能的客观性^[18]，能够作为肝细胞功能 评价的定量指标^[19'^M]。ICG是一种无毒的红外感光 色素，注入体内后能与血清白蛋白结合。两分钟左 右在血液中均勻分布，高效率、高选择性地被肝细 胞吸收，再以游离的形式分泌至胆汁中排入肠道。 由于ICG不会发生肠肝循环、生物转化、无淋巴逆 流、不经肾脏代谢、无不良反应，其已经成为检测 肝脏储备功能最为理想的指标^[21]。该试验通常是以 K值及R15作为检测项目。

本试验中，在4种由轻到重的肝炎类型组中，

其R15都具有显著差异，这说明肝病的严重性影响 了肝细胞的储备功能；K值在CH- I和CH-II组， CH- II和CH- III组中无显著差异，在CH- III和LC 组中大幅提高，说明前两组的肝功能储备虽然有一 定差异性，但是差异不大。这种细微的差距，表 现在R15的差异上，而K值却未表现出来。K值 的结果与肝纤维化指标的结果是类似的。INF-y在 CH- III和LC组中未表现出差异性，但在其他组中 有显著差异，这种现象可能说明在相近的肝炎类型 中肝纤维化的程度可能比较相近或者肝功能具有极 强的代偿性掩盖了这几种指标的差异性。单纯利用 这几种生化指标很难分辨其中区别。

在本试验中，对试验组进行病理或组织检查， 确定每个病例的肝纤维化程度。同时检测肝纤维化 指标HA、LN、PC-III和抗纤维化细胞因子INF-y 以及ICG排泄试验中的K值和R15。肝纤维化指 标HA在各组间无差异，这可能和肝脏的代偿功能 或是其他因素相关^[14]。LN和PC-III在各组间差异 较大，其值依次升高，表明该指标与纤维化程度呈 正相关。取卩-丫在8₂组和8₃组中无显著差异（尸= 0.621),其余各组间均有显著差异（P< 0.01), 其值依次下降，表明该指标较为敏感。K值在相近 的两个组别中无显著差异，敏感性不高；R15较为 敏感，其值依次上升。表明ICG排泄试验合并肝纤 维化指标在分辨各种程度肝纤维时可分析出其中差 异，较有可行性。

本课题探讨了各个指标间的关系，K值与肝纤 维化指标呈负相关的线性关系，与INF-y呈正相关 性，表明该数据与肝脏纤维化以及抑制肝纤维化细 胞因子有一定相关性；INF-y和HA与LN呈负相关， 而与PC- III无显著相关性，同时R15与肝纤维化指 标也未表现出相关度，可能提示单纯用一种类型的 指标去推断肝脏的纤维化程度有一定的局限性。

本试验通过检测肝纤维化指标、INF-y、K值 和R15等指标发现综合利用以上数据更能够精确 进行无创性肝纤维化诊断。通过ICG排泄试验， 在监测肝脏储备功能的同时，还可以推断肝纤维化 程度，为无创性检测肝纤维化提供一种新的手段和 方法。

   成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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