肝纤维化诊断中的价值与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法*
肝纤维化诊断中的价值与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法*
摘要
冃的:测定不同肝病忠者及四氧化碳处理的大鼠血清7S胶原和VI型胶原含量井研究其含量增高的
临床价值。方法:以自行提取的人胎盘IV型胶®7S片段(7SK原.7S-C)与VI型胶原片段(V1-C)制备兔抗血清，建
立放射免疫分析法(RIA).检测了40例健康成人,16S例多种肝病及部分非肝病患者及52只四氯化碳诱发肝纤维 化的大鼠血清7S-C及V1-C含量.结果:慢性活动性肝炎、肝硬化与肝细胞癌忠者血清含量均显著高于正常对
照(PC0.01);慢性迁延性肝炎和某些非肝病患者也有增高(PC0.05);血清7S-C含量与血淸层粘连蛋白及透明 质酸含量有良好的相关性（r分别为0.695与0.834，尸<0.05).血清7S-C与VI-C含量相关不显 著(r=0.560, P>0.05).在肝纤维化造模大鼠的肝细胞变性坏死期，这两种胶原血淸含量即开始显著增高，并与 肝纤维化程度呈正相关。结论:血清7S-C及V1-C测定对肝纤维化的诊断有重要价值，血淸1V-C, V1-C与其它结 缔组织代谢或生化指标联合检埘将有助于肝纤维化的诊断.
关键词放射免疫分析 7SK原 VI型胶原 肝纤维化
近年来随着血清结缔组织多肽免疫学测定研究 的进展，血清IIV、VI型胶原多肽的定量分析，已 被认为是动态观察肝纤维化过程及抗肝纤维化疗效 的重要指标[|]。本研究首次在国内采用自行提纯和制 备的人7S胶原（7S-C)、VI型胶原（VI-C)及其抗血
[1]国家fl然科学基金资助项目，基金号391TO3S9 作者单位：200433上悔市，第二军医火学长海医院(纪徐淮第二军医 人学长征医皖<李石.孔宪涛、谢映华S防科：L委第514医院晓晶X海 军医学研究所同位菜中心(陈金国）
清W ,建立了放射免疫分析法(RIA),检测多种肝病及 部分非肝病患者168例.结合四氯化碳(CC1J诱发不 同阶段肝纤维化大鼠血清含量的变化，探讨其对肝纤 维化的诊断价值.
材料与方法
一、检测对象
肝病:急性病毒性肝炎(AH>15例，慢性迁延性肝 炎(CPH>56例，慢性活动性肝炎(CAH)19例，肝炎后 肝硬化(LC)15例，以上诊断均按1990年全国病毒性
肝炎会议修订的标准=肝细胞癌(HCC)18例（其中10 例合并肝硬化,HCC+LC),均经手术病理证实.非肝 病包括尿毒症.糖尿病、甲亢、SLE,消化性溃疡、胃癌 及直肠癌共45例，均为住院确诊者(肿瘤患者均经病 理证实)。取空腹血分离血清，_40°C保存待测。另以 40例健康献血员血清为正常对照，
二、大鼠肝纤维化模型制备，血清采集和肝组织 免疫组化染色
雄性SD大鼠52只，体重200〜250g,以CCU
1. 31111/10〇11^体重皮下注射，每周2次.于造模后2,4, 8.12,16周各处死9只(死亡7只)心脏取血，一40°C保存 待测•同时取肝组织石蜡切片作HE染色和ABC法免 疫组化染色，抗体为自制兔抗人7S-C与VI-C血清。大 鼠肝纤维化分期采用Al〇-kk0法M进行。正常对照血 清取自同批28只健康SD大鼠。
三，7S-C与VI-C的RLA测定
取待测血清l〇〇/il,加抗血清l〇〇/il和PBS,
1.1 04吐温20 100/il,再加人标准抗原及1ZSI-7S-C或 U5卜VI-C.4°C反应过夜，加入固相二抗1小时， 3000rpm离心，弃上清，测定沉淀物放射活性，建立标 准曲线，井确定各样本浓度值.
血清层粘连蛋白(LN)U]、透明质酸(HA)[5]、血清 谷丙转氨酶（ALT)、胆红素（BIL)、碱性磷酸酶 (ALP)、白蛋白/球蛋白(A/G)测定，均按常规方法。
结 果
—、RIA方法学鉴定
(一)灵敏度:7S-C与VI-C分别为2〜8ng/ml与5 〜10ng/mL
㈡精密度:批内变异7S-C与VI-C分别为8.2舛〜 11.2%与5,23%〜7.81 %;批间变异分别为7.58%〜 11.23%与 6,48%~ 11.721
㈢准确度：回收率7S-C与VI-C分别为98舛与 95瓜线性良好。
2. 各神肝病与非肝病患者血清7S-C与V1-C含
量。 '
见表1。
三、 7S-C, VI-C与LN、HA及肝功能的相关性
肝病组织中86例同时检测了HA与LN,血清
7S-C浓度与HA、LN呈正相关（r分别为0.834与
2.2 695,户<0.05)而VI-C与其无相关性（r分别为0.612 及0,478,户>0.05)。血清7S-C与VI-C相关不显著(r为 0,560,_P>0.05). 7S-C, VI-C均与A/G呈负相关,
Chin J Dig. June 19&7, Vol.17, Nq.3
表1患者血淸7S-C. VT-C含量^土s)
|
组别 |
例数 |
7S-C |
pn* |
|
pm.* |
|
正常对照 |
40 |
8.25±〇.6S |
|
1M6±6,28 |
|
|
肝病组 |
123 |
|
|
|
|
|
AH |
15 |
9.CU±Ci 69 |
NS |
21 35 土 6.59 |
NS |
|
CPH |
66 |
11.09 士 141 |
<0.05 |
2S.52 土 9,32 |
<0.05 |
|
CAH |
19 |
23.28 士 3.16 |
<0.01 |
56.38 ±25 42 |
<0：OL |
|
LC |
15 |
28.94 士 3.08 |
<0-01 |
48.95 ± 23.02 |
<0.01 |
|
HCC+LC |
10 |
26 52 ±2.97 |
<1乂丨]1 |
收21土 20.52 |
<0.01 |
|
HCC |
8 |
20.31 ±2.82 |
<1)-〇1 |
40 05土21].36 |
<0.01 |
|
非旰病组 |
45 |
|
|
|
|
|
域毐症 |
10 |
12.03 ±1196 |
<{].03 |
21 0L 士 8.32 |
NS |
|
甲亢 |
S |
12』9 土 L23 |
<化05 |
19 .&3 士 9.16 |
NS |
|
糖尿病 |
3 |
11.91 士 143 |
<0.05 |
19 98-9.32 |
NS |
|
直肠葙 |
7 |
13 26 士 2.16 |
<0.05 |
25.3S+5.77 |
<0.05 |
|
R癌 |
5 |
9.0S 士 0.89 |
NS |
24,13x5,35 |
<0,05 |
|
SLE |
2 |
14.83 土 2.08 |
<1),〇5 |
29,8 ±4 93 |
<-1105 |
|
消化件溃疡 |
10 |
3.76 ±0.52 |
NS |
19_02士7.03 |
NS |
*与7E#对照组相比
与ALT、BIL呈正相关，与ALP无相关性。
四，肝釺维化造模大鼠血清7S-C与VI-C含量及 其与肝脏病理改变的相关性
7S-C与VI-C血淸含量变化，见表L它们与肝 组织病理所见(表3)中的细胞坏死及肝纤维化程度呈 正相关，与气球样变性及炎细胞浸润不相关.免疫组 化结果显示.肝组织的沉积随肝纤维化进展而逐渐増 加。
表2 CCUf纤维化造模大鼠血清7S-C、V1-C含量土幻
|
CC]4闬药周数 |
例数 |
7S『C(ng/ml) |
Vl-C(ng/m]) |
|
JF常 |
28 |
8.95 士 2 17 |
21.35 ±2.33 |
|
2 |
9 |
13.45 士 2^8*= |
28-14±丨2” |
|
4 |
9 |
1_3JT5 士 |
3(X05±3-73 + |
|
8 |
9 |
13.92 ±2.73^ |
29.77 士 3 59# |
|
12 |
9 |
12.94 土2.0， |
2139 士 2_36* |
|
16 |
9 |
12 05 土 2,00* |
25_42士3.02* |
与IH常对甩组柑比，p<0 .
表3肝纤维化大鼠组织学病理评分(王土 s)
|
组别 |
例数 |
肝细胞坏死 |
气球样变 |
炎细胞浸润 |
纤维化 |
|
正常 |
4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
9 |
2.1 ±0.8 |
L5±0.4 |
1 6土 04 |
0.3 ~ 0.4 |
|
4 |
9 |
2.7 ±H6 |
1 6士05 |
1-5 ± CU |
L5±0.7 |
|
8 |
g |
L9 土 CI.R |
27士1,1 |
L9土 0 7 |
2_6 士 U |
|
12 |
9 |
|
2.8 土 13 |
2'0士0 9 |
2 9±卩.：3 |
|
16 |
9 |
1.0 士 09 |
3.0 士 () |
2 1 土06 |
3,0-0 |
中华消化杂志1997年6月第F7卷第3期
讨 论
1V-C、VI-C是非形成原纤维胶原（Non-fibrU- for-ming)家族中主要组成部分，它们虽含胶原的特 有结构.但在体内并不直接形成原纤维，而起到直接 或间接与原纤维、细胞膜受体、细胞相互结合、粘附与 调节作用，1V-C又是基底膜的主要组成成份之一.肝 纤维化过程中，二者在肝组织的含量可成倍增加，在 血清中含量增加更为明显。在现有的10多篇文献中. 均把iv-a vi-c血清浓度改变当作肝纤维化的重要 血清学指标[| •汰
本文的资料表明，CPH,CAH,LC和HCC患者血 清7S-C与VI-C含量显著高于正常，尤其以CAH、LC 及HCC增高更为显著，两者超过正常值范围(S±2s> 的比例在CPH为35舛与31舛，C AH为86 %与 75%,LC为81 %与83IHCC+LC为84%与87舛，显 示其对后三者慢性肝病的诊断具有一定的敏感性与 特异性。两者在CPH虽均有增高，但幅度较低，与 CAH.LC较少有重叠。血清7S-C与VI-C含量相关不 显著，说明这两种胶原在体内具有不同的代谢动力 学。它们与肝功能指标中ALT，BIL、A/G相关，结合 肝纤维化造模大鼠不同阶段血清含量的变化及其与 肝脏病理改变的相关性，表明它们在反映肝纤维化及 肝细胞損伤方面有较大价值.Ala-kkokam等也指 出，7S-C在反映早期肝纤维化的敏感性与纤维化活 动方面甚至优于血清PfflNP检测。
血清7S-C与V1-C来源于组织IV-C, VI-C的降 解[6]，其血清含量增高反映组织内新生成或已沉积的 1V-C、V1-C降解增加dIV-C为基底膜的主要成分之 一，降解增加的同时常伴有更多新的合成，Milani 等发现在二甲亚硝胺诱发的大鼠肝损伤 中，1V-C mRNA表达与血清1V-C水平的升高密切相 关即说明了这一点，因此，血清7S-C含量实际反映了 基底膜胶原的更替状况.肝病患者其血清含量增高， 反映了肝窦毛细血管化和汇管区小胆管血管的增生。 Loreal等[a]认为肝脏中VI-C含量的减少有助于间质 胶原的降解，其在慢性活动性肝病时的升高往往为反 应性的.因此血清中V^C含量愈高,增加速度愈快.则 此时的纤维降解愈明显。在肝纤维化中后期，免疫组 ft显示二者血清含量与肝组织内相应胶原沉积增加 一致，说明此时血清含量增髙亦与沉积于肝组织的 1V-C、V1-C降解增加有一定的联系1而V1-C的分布 往往与间质性K m型胶原呈共同分布，其降解的增 加同时反映了间质型胶原在体内的降解状况■■动态观察它与反应胶原生成的in型前胶原氨基末端肽 (pniNP)两者血清含量的变化，可为肝纤维化病变的 趋向提供更多信息。
本文的结果还表明，HCC患者血清二者含量增 加可能与肿瘤浸润性生长过程中肝脏产生更多的细 胞外基质(包括iv-c、vi-c)加以包绕有关，也不能除 外癌组织本身产生lv-avi-c的可能性。在非肝病组 中除消化性溃疡外，均有所增高，说明除肝脏组织 夕卜,其他部位的结缔组织中亦含有一定量的非原纤维 形成胶原，其中7S-C在尿毒症、甲亢、糖尿病、SLE时 均有所增加，而VI-C在肿瘤及SLE时偏高，在诊断肝 病时应注意加以鉴别。直肠癌患者血清7S-C偏高可 能与2例合并肝转移有关。无论何种慢性肝病,胶原降 解酶的活力均决定血清1V-C、VI-C的含量。因此，有 必要进一步观察血清1V-C、VI-C含量变化与肝脏内 胶原降解酶(金属蛋白酶2等)活力改变的关系。
综上所述，血清7S-C.VI-C的RIA测定可较好地 反映肝脏内iv-avi-c的代谢状况，是反映胶原降解 有价值的指标，有助于对肝纤维化的早期诊断与预后 判断，可望成为抗肝纤维化治疗疗效判断的动态观察 指标之一。
成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪
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