诊断超声介导微泡提高肝纤维化通透性及促进基因传递与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

 [摘要]目的成都华西华科研究所研究探讨诊断超声联合微泡对肝纤维化组织通透性的影响及其介导基因转染肝纤维化大鼠的有效性。方 法采用二甲基亚硝胺（DMN)法建立大鼠肝纤维_化模型，80只大鼠在建模第4周末随机分为：模型对照组、单纯微泡组、 单纯超声组和诊断超声联合微泡组。分别进行肝纤维化微血管通透性实验和基因转染实验，采用激光共聚焦显微镜观察 伊文思蓝（EB)在肝纤维化组织内分布情况，同时定量检测肝纤维化组织内EB的含量，评估不同分组微血管通透性。荧 光显微镜下观察含增强型绿色荧光蛋白报告基因的质粒转染大鼠肝纤维化模型的基因表达情况。结果激光共聚焦显 微镜显示诊断超声联合微泡组纤维化肝实质内可见明显的EB红色荧光。诊断超声联合微泡组纤维化肝组织中EB含量 明显高于其他3组（P<0. 05)。荧光显微镜下观察，相比其余3组，诊断超声联合微泡组增强型绿色荧光蛋白最多，基因 转染效率最高。结论诊断超声联合微泡在提高纤维化肝脏微血管通透性的同时可促进基因传递。

[关键词]超声检査；微泡•，肝纤维化•，基因传递

肝纤维化是对肝脏慢性损伤的一种不适当修复，具 有较高的发病率和死亡率^[1]。基因干扰技术是当今抗 纤维化治疗的热点^[2_3]。有效的基因传递是基因治疗成 功的最重要因素。研究^[4]发现，超声介导微泡破裂技术 可一过性提高毛细血管通透性，促进基因传递，已成为 一种新型、安全、有效的基因传递方法。目前多数研 究^[5—^6]采用低频治疗超声介导微泡破裂。本研究采用临 床常用的诊断超声,探讨诊断超声联合微泡提高纤维化 肝组织的通透性并在纤维化肝组织实现基因转染的可 能性，为肝纤维化的耙向治疗提供实验室基础。

1材料与方法

1.1实验动物与材料SPF级SD雄性大鼠80只，体 质量210〜230 g，购于第三军医大学动物实验中心。 阳离子微泡造影剂为第三军医大学新桥医院超声科提 供，浓度约6.5X10⁸/rnim。实验用材料有伊文思蓝 (Evans blue，EB;Sigma 公司）、二甲基亚硝胺（0丨1116- thylnitrosamine，DMN;天津化工厂）、4'，6-二脉基-2- 苯基口引味（4,6-diamidin〇-2- phenylindole-2-HCl，DA- PI;A_PPliCh_em公司）、含增强型绿色荧光蛋白的质粒 BLOCK-iTTM Pol IlmiR RNAi Expression Vector (Invitrogen公司）、质粒大提试剂盒（Qiagen公司）、 Masson试剂盒（福建迈新公司）。HE染色试剂由第 三军医大学新桥医院病理科提供，其他试剂由广州化 学试剂厂生产(分析纯）。

1.2实验仪器GE Vivid 7型超声诊断仪（配有10L 及M4S探头），DU800紫外分光光度计(Beckman),冷 冻切片机（Leica，CM 1900)，激光共聚焦显微镜（Lei- ca)，荧光显微镜（Leica)。

1.3肝纤维化动物模型制备SD大鼠腹腔注射稀释 后的1% DMN1 ml/kg体质量，每周连续3天，每天1 次，共注射4周制作肝纤维化模型。~

1.4方法

1.4. 1肝纤维化组织微血管通透性实验将40只建 模成功的SD大鼠随机分为模型对照1组、单纯微泡1 组、单纯超声1组和诊断超声联合微泡1组，每组10 只。2%戊巴比妥钠40 mg/kg体质量腹腔注射麻醉， 采用8%硫化钠脱毛处理整个大鼠腹部，采用10L高 频探头实时显示肝脏，进行标记，切换至M4S低频探 头。对模型对照1组大鼠尾静脉团注50 mg/kg体质 量的2%无菌EB溶液，后跟注0.2 ml生理盐水；单纯 微泡1组给予相同剂量EB溶液后，再给予

1.  25 ml/kg体质量的阳离子微泡造影剂，然后予以 0• 2 ml生理盐水；单纯超声1组注射相同剂量EB溶

液后，追加〇. 2 ml生理盐水，同时给予经皮超声辐照； 诊断超声联合微泡1组团注同样剂量EB溶液后，给 予0.25 ml/kg体质量的阳离子微泡溶液，然后跟注

1.1    2 ml生理盐水，同时进行超声辐照。辐照频率1.5 MHz/3.2 MHz，辐照时间10 min,间歇触发式辐照， 机械指数1. 〇,辐照过程参照文献[8]。

实验结束30 min后开胸，自左心室插管入主动 脉，剪开右心耳，灌注肝素化的生理盐水至流出液体变 清亮。取出部分肝组织行快速冷冻切片，厚约7 jum， DAPI染色，激光共聚焦显微镜下观察肝纤维化组织 中的荧光表达情况。10%中性甲醛固定部分肝组织后 石蜡切片，行HE染色、Masson胶原染色。余肝脏组 织称重后，剪碎，加人甲酰胺勻浆，置于37'C水浴箱中 孵育48 h以充分提取其中的EB。高速离心5 min后， 取1 ml上层液，DU800紫外分光光度计测定620 nm 最大吸收峰波长下的吸光度值。根据绘制好的EB溶 液标准曲线（Y=33. 711X_0.041,X为吸光度值，Y 为EB含量）分别计算各组肝纤维化组织中的EB 含量。

1.4.2基因转染将建模成功的剩余40只肝纤维化 大鼠随机分为以下4组，每组10只：①模型对照2组， 只给予0. 2 ml生理盐水；②单纯微泡2组，尾静脉注 射0• 25 ml/kg体质量阳离子微泡与0• 20 mg/kg体质 量质粒混合溶液；③单纯超声2组，尾静脉注射

2.  20 mg/kg体质量质粒后进行超声辐照；④诊断超声 联合微泡2组，尾静脉注射0. 20 mg/kg体质量质粒 与0.25 ml/kg体质量阳离子微泡混合溶液，同时进行 超声辐照。所有超声辐照参数及过程同方法1.4.1。 实验结束，2%戊巴比妥钠40 mg/kg体质量腹腔注射 麻醉，开腹后每组取相同部位肝组织并以10%中性甲 醛固定，缝合伤口，腿部肌肉注射青霉素钠（80万U/ 瓶)3天；将所取肝组织石蜡切片，HE染色、Masson 胶原染色。各组分别于转染后第4天获取肝纤维化模 型大鼠肝组织，快速冰冻切片，荧光显微镜下观察增强 型绿色荧光蛋白的表达情况。

1.5肝纤维化程度的判断将肝纤维化分为〇〜4 期^[91°^]:〇期为正常肝组织，无纤维化；1期为汇管区纤 维化扩大，局限于窦周及小叶内纤维化;2期为汇管区 周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；3期为纤 维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；4期为早期肝硬 化。由2名资深病理科医师参考慢性肝炎肝纤维化半 定量计分标准™进行计分，见表1»对于Masson染 色的每张切片随机选取3个视野，按照肝纤维化半定

量计分系统进行计分。

表1肝纤维化半定量计分系统^D°^]

计分	小叶静脉 周/窦周（L)	汇管区 (P)	纤维间隔-
			数量(n)	宽度(W)
0	无	无	无
1	局限、少数	扩大无隔	<6/10 mm	细
2	弥漫、多数	扩大有隔	>6/10 mm	疏松、宽
3	—	肝硬化	肝硬化	致密、宽
4		—		>2/3活检面积

注:计分=L+P + 2X(nXW): * :标本内仅一细纤维隔，W计分 〇. 5;间隔宽度居两者之间者.计分取平均值

2.  6统计学分析采用SPSS 17. 0统计分析软件。 计量资料以表示，组间差异采用单因素方差分 析，各组间肝纤维化程度比较采用多个独立样本秩和 检验。以P<0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1激光共聚焦显微镜观察结果模型对照1组、单 纯微泡1组以及单纯超声1组EB红色荧光主要分布 在血管内，肝纤维化组织内未见明显红色荧光（图1A 〜1C)。诊断超声联合微泡1组EB红色荧光除分布 在血管内，还渗透到蓝染的肝细胞核周围肝纤维化组 织内（图1D)。

1.2    EB含量测量结果模型对照1组、单纯微泡1组 及单纯超声1组EB含量较低，单纯微泡1组和单纯超 声1组与模型对照1组比较差异均无统计学意义（P>

3.  05)，单纯微泡1组与单纯超声1组比较差异亦无统 计学意义(P>〇.〇5)。诊断超声联合微泡1组EB含量 明显增加,与其余3组比较差异均有统计学意义CP均 <0.05,图 2)。

2.3增强型绿色荧光蛋白表达情况模型对照2组

未见荧光（图3A)，单纯微泡2组肝纤维化组织中可见 少量的增强型绿色荧光蛋白表达（图3B);单纯超声2 组肝纤维化组织可见增强型绿色荧光蛋白表达（图 3C),诊断超声联合微泡2组肝纤维化实质内可见明 显大量的增强型绿色荧光蛋白（图3D)。

2.4各组大鼠肝纤维化程度肝纤维化分期多数达3、4 期。模型对照1组、单纯微泡1组、单纯超声1组、诊断超 声联合微泡1组肝纤维化程度计分分别为(13. 57士3. 67) 分、(14 03士3.04)分、（12.93±3. 60)分、（13.19土3.12) 分，各组纤维化程度差异无统计学意义(P=〇. 830);模型 对照2组、单纯微泡2组、单纯超声2组、诊断超声联合微 泡2组肝纤维化程度计分分别为（13. 80 士 2. 64)分、 (13. 41 士3. 38)分、（13. 64±3.63)分、（12.86士3.04)分，差 异无统计学意义(P=〇. 089 8),见表2。

表2各组大鼠纤维化程度（只)

组别	〇期	1期	2期	3期	4期
模型对照1组(《=1〇)	0	0	1	5	4
单纯微泡1组(〃=1〇)	0	0	0	5	5
单纯超声1组（《=10)	0	0	0	6	4
诊断超声联合微泡1组U=10)	0	0	1	5	4
模型对照2组（n=10)	0	0	0	5	5
单纯微泡2组U=10)	0	0	1	5	4
单纯超声2组(》=10)	0	0	0	6	4
诊断超声联合微泡2组(《= 10)	0	0	0	6	4

3讨论

正常肝血窦内皮细胞有许多窗孔，内皮下缺乏基 底膜。肝纤维化特别是肝硬化形成时，肝窦内皮细胞 窗孔几乎消失，内皮下形成完整的基底膜，使肝窦毛细 血管化，微血管通透性下降，干扰物质从肝窦向肝细胞 的运输及肝脏的血液循环^n]。

图I EB在肝纤维化组织中的分布A〜C.分别为模型对照1组、单纯微泡1组及单纯超声1组，肝组织内未见明显EB红色荧光；D.诊 断超声联合微泡1组.蓝染的肝细胞核周围肝组织内可见明显红色荧光

模型 单纯微 单纯 诊断超声 对照1组   泡1组   超声1组联合微泡1组

0

图2各组EB含量直方图

:与其余各组比较，P<〇. 05

将外源基因特异性转人肝组织甚至肝细胞并在其 中靶向高效地表达，是进行肝纤维化疾病基因治疗的 关键。近年来，超声介导微泡破裂技术被广泛用于基 因和药物的传输,其机制多数认为是由于超声波和微 泡造影剂的相互作用，所产生的空化效应可使局部微 循环血管内皮细胞连接及靶细胞膜可逆性损害引起微 血管通透性增加.从而促进基因或药物传递^[12]。

EB是一种深蓝色粉末状的偶氮荧光染料，人血 后可与白蛋白稳定结合，形成大分子复合物.正常情况 下该复合物不会透过血管内皮细胞，因而被广泛用 于评价微血管的通透性^n3]。在620 nm激发光波长 下EB可在激光显微镜下被激发显示出红色荧光, DAPI可与细胞核中的DNA结合，在359 nm激发光 波长下可被激发显示出蓝色荧光，可间接地反映微 血管的通透性。通过测定渗出血管外组织中EB的 含量，可进一步定量反映组织微血管的通透性。

本研究发现单纯微泡1组、单纯超声1组及模 型对照1组EB红色荧光主要局限于纤维化肝血管 内，肝纤维间隔内也可呈现红色荧光，提示单纯微泡 及单纯超声辐照对纤维化肝脏微血管通透性无明显 影响，而诊断超声联合微泡1组与其余3组比较，EB 红色荧光除分布于肝血管内，还可渗透至血管外肝 纤维化组织内，提示诊断超声联合微泡可以提高肝 纤维化组织中微血管的通透性。EB定量实验结果 进一步表明单纯微泡1组、单纯超声1组与模型对 照1组比较差异均无统计学意义，提示单纯微泡并 不能提高肝纤维化组织中微血管的通透性；单纯超 声辐照也未提高肝纤维化组织的微血管通透性，其 原因考虑主要是本研究所用诊断超声相比治疗超声 能量较低、空化效应作用不强所致。而诊断超声联 合微泡1组与其余3组比较差异均有统计学意义， 明显提高了肝纤维化组织中微血管的通透性，提示 这种效果是诊断超声和微泡造影剂的相互作用所 引起。

有研究w发现诊断超声联合微泡可暂时提高肝 癌的毛细血管通透性，但进一步的的裸基因转染实验 表明，诊断超声联合微泡并未促进基因在肝癌组织中 的表达。Geis等^[15研究发现诊断超声联合微泡注射 尽管不能提高心肌血管的通透性，但可安全有效地提 高心肌基因转染效率。因此本研究所用诊断超声联合 微泡虽然引起大鼠肝纤维化组织微血管通透性增加， 但能否促进基因在肝纤维化组织中的表达还需进一步 研究。采用带增强型绿色荧光蛋白报告基因的质粒载 体进行体内转染实验，通过获取纤维化肝组织切片，在 炎光显微镜下可以直接观察到基因在靶组织中的表达 情况。本研究结果显示诊断超声联合微泡2组较其余 3组可见明亮的绿色荧光表达，基因转染效率最高。

图3荧光显微镜下增强型绿色荧光蛋白在肝纤维化组织中的表达情况（X200) A.模哦对照2组未见绿色荧光：B.单纯微泡2组仅见少 量增强型绿色荧光蛋白表达；C.单纯超声2组可见增强型绿色荧光蛋白表达；I).沴断超声联合微泡2组可见大#增强型绿色荧光蛋白 表达

不同的超声参数和超声造影剂浓度对微血管通透 性及基因的转染和组织细胞有不同的影响。本研究所 用条件为前期诊断超声联合微泡可有效安全提高正常 大鼠肝脏微血管通透性的条件，对超声参数未进行进 一步的条件优化。本实验所用微泡剂量较大，能否应 用于临床还需进一步研究。

总之，本研究表明诊断超声联合微泡能提高肝纤 维化组织中的微血管通透性，也可促进报告基因在纤 维化大鼠肝脏内的有效表达，为下一步肝纤维化的耙 向治疗提供了一种有效的基因传递方法，但其具体机 制还有待进一步研究。

 成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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