肝纤维化非损伤性检测方法的研究进展与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

肝纤维化(liver fibrosis)是肝脏对各种原因所致肝损伤 的创伤愈合反应，表现为肝内结缔组织增生和沉积。传统对 于肝纤维化或肝硬化的临床诊断依赖于肝穿剌活组织检査 (肝活检），并且仍以组织病理学检査最为可靠，但这是一项 有创性检査，且存在显著的取材误差，另外，只能对纤维化 进行大致的静态评估，不能反映其动态过程。这就需要有效 的非损伤性检测方法，目前已应用于临床的生化标志物有 透明质酸、层黏蛋白、I型前胶原氨基末端肽及IV型胶原， 然而由于受多种因素影响，尚不能作为确诊肝纤维化的指 标，联合检测有一定的参考价值。近年，许多检测肝纤维化 的非损伤性方法在生化、实验和临床等各领域广泛发展^ 本文对其研究进展作了综述。

基质金属蛋白酶和基质金厲蛋白酶组织抑制因子

肝纤维化的主要病理变化为细胞外基质（extracellular matrix,ECM)在肝脏中过多沉积，研究发现基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)在降解过多 ECM 的过程中 起主要作用，其中MMP-1在降解ECM主要成分I、ffl型胶原 的过程中起重要作用^w。而对MMP-1活性起主要抑制作用的 是 MMPs 组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase， TIMP)-1,在肝纤维化过程中TIMP-1通过MMP_S(主要是 MMP4)活性的抑制，抑制I、ffl型胶原等的降解，从而导致 ECM在肝脏内的过度沉积，促进肝纤维化的形成和发展气

尹珊珊等^研究表明慢性乙型肝炎患者血清中的！11^0>- l、MMP]、MMP-2和T1MP-1/MMP-1与纤维化分期的相关系 数为 0.540、-0.495、0.314 和 0.269,差异均有显著性，MMP-1、 TIMP-1及MMP-2对肝纤维化的判别价值优于MMP-9及 TIMP-2。而MMP-1及TIMP-1对于诊断早期纤维化的敏感性 较高，若以210.04ng/mL为临界值，TIMP-1诊断肝硬化的特 异度达92.3%,高于其他指标。TIMP-1及MMP-1与肝组织 内汇管区炎症、小叶内炎症、碎屑坏死和桥接坏死具有相关 性，且以TIMP-1的相关性更好，由于碎屑坏死和桥接坏死 是影响肝病患者预后的重要因素，提示TIMP-1不仅可检测 肝纤维化程度，同时对于判断慢性肝病患者的预后也具有 一定价值。

进一步研究发现慢性乙型肝病患者不仅血 清TIMP-1水平明显髙于正常对照组、血清MMP-1明显低于 通讯作者：吴云林 E-mail: 

正常对照组，而且随着慢性乙型肝炎由轻度向肝硬化进展， 血清MMP-1水平逐渐降低，除慢性肝炎重度与肝硬化之间 比较差异无显著性外，慢性肝炎轻、中度与重度之间比较差异 均有显著性，而血清TIMP4水平逐渐升髙，至肝硬化阶段达 最高峰，各组间两两比较差异有显著性。因此，血清MMP-1 及TIMP-1可作为肝纤维化的判断指标,且对判断慢性乙型肝 炎病情轻重方面也有一定的临床意义。聂青和¹⁸¹发现TIMP-1 在病损肝脏中明显增高，出现的时间较早，幅度较大,其对肝 纤维化及早期肝硬化的诊断价值优于MMP-1。

最近Giiha等¥实了一个可诊断肝纤维化的生化标志 物方案，对192例转氨酶升髙并行肝穿剌的非酒精性脂肪 性肝病患者进行研究，发现欧洲肝纤维化指标增强肝脏纤 维化(enhanced liver fibrosis，ELF)分组对分辨严重纤维化的 曲线下面积（AUC)为0.90、中度纤维化为0.82、无纤维化为 0.76JLF包括3个肝纤维化血清学指标，即TIMP4、透明质 酸及m型前胶原氨基末端肽。去除年龄因素后，对诊断没有 影响。增加单一标志物，提高了诊断效能(相应AUC分别为 0,98、0.93和0.84)。若采用ELF或联合检査，可以避免82% 和88%的重度肝纤维化患者肝活检。

细胞角蛋白

除ECM的沉积，肝纤维化还伴随肝细胞不断凋亡胃。凋 亡蛋白质酶将其底物细胞角蛋白(_Cytok_emi_n,CK)18水解后 会产生新表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认 凋亡细胞，从而检测出肝脏的纤维化i¹¹¹。CK18被水解后产 生的新表位，即M30抗原，在细胞凋亡早期半胱天冬蛋甴酶 (caspase)断裂时就可被检测到，但不能在病毒或坏死细胞 中被检测到。另外，未被水解的CK18,即M65抗原，其细胞 溶质在细胞坏死时从细胞释放出来。这些发现提示，通过评 估患者血清中CK18的不同形式可检测体内细胞死亡的不 同方式，如M30抗原代表凋亡，而M65抗原代表坏死叫。

Yilmaz等^研究显示非酒精性脂肪性肝炎患者的M30 抗原和M65抗原水平明显高于单纯性脂肪肝及正常肝脏。 M30抗原的异常值（>121.60 U/L)对诊断非酒精性脂肪性肝 炎的灵敏度为60.0%，特异度为97.4%。M65抗原的异常值 (>243.82 U/L)对诊断非酒精性脂肪性肝炎的灵敏度为68.9%, 特异度为81.6%。此外，M30抗原和M65抗原还可鉴别非酒 精性脂肪性肝病患者的肝硬化和早期肝纤维化，灵敏度分别为64.7%和70.6%,特异度分别为77.3%和71.2%,两者的 诊断价值相似。如果与计算机体层摄影术(computerized to­mography, CT) 相结合，M30 抗原对诊断非酒精性脂肪性肝 炎的灵敏度及特异度则为86.1%和83.3%,而M65抗原的 灵敏度及特异度则均提高至83.3%。

Papatheodoridis等¹¹⁴¹研究表明CK18水平能很好区分无 症状携带者与慢性乙型肝炎患者，其对诊断慢性乙型肝炎 的临界值为240 U/L,灵敏度为60%,特异度及阳性率为 100%。同时还发现无症状携带者的CK18水平仍低于丙氨 酸氨基转移酶（ALT)暂时正常的慢性乙型肝炎患者，表明 CK18可帮助诊断部分因ALT波动很大而难确诊的乙型肝 炎病毒e抗原（HBeAg)明性的慢性乙型肝炎。分析发现慢性 乙型肝炎患者CK18的血清值与ALT/天冬氨酸氨基转移酶 (AST)比值、病毒血症、分级及肝脏免疫组化表达呈正相关， 与血小板计数呈负相关，但与纤维化或脂肪变性程度无关， 因此不能评估慢性乙型肝炎患者肝脏组织损伤的严重程 度，这点很难解释。因为肝坏死炎症通常与纤维化程度相 关，一个可能的原因是慢性乙型肝炎纤维化的程度与坏死 炎症的其他非调亡因素有关。

人体微纤维关联性蛋白4

M0丨leken等M发现一个新的生化标志物，即人体微纤维关 联性蛋白 4 (human microfibril-associated protein 4，MFAP-4)， 免疫组化实验提示其大量存在于肝星状细胞和肝硬化的 ECM中，且其血清浓度对鉴别正常肝脏与肝硬化有高度诊 断价值，并与丙型肝炎肝纤维化的分期呈正相关。临界值设 为24 U/mL时，其对诊断丙型肝炎肝硬化的灵敏度为 91.6%,特异度为95.6%,对酒精性肝硬化的灵敏度和特异度 分别为75%和95.6%。MFAP4是一广泛存在的蛋白，在纤 维形成过程中对ECM的转变起潜在作用。另外，依靠钙与 肺中不同的胶原凝集素相互作用，随后可能在炎症过程中 将胶原凝集素固着于ECM。由于此蛋白对基质转变的作用 尚无相关证据，故而其在肝纤维化中作用于ECM及胶原互 相影响的过程只能是一个假设。

其他血清学指标

Gangadharan等M新发现丙型肝炎肝硬化患者血清中 的间-ot-胰蛋白酶抑制因子重链H4(inter-a-tryp8in inhibitor heavy chain H4,ITIH4)、补体因子 H 相关蛋白（factor H- related protein” 及载脂蛋白（apolipoprotein,Apo) La 明显减 少，而 CD5 抗原相似蛋白（CD5 antigen-like protein,CD5L)、 P2 糖蛋白 1 (P2 glycoprotein 1, p₂GPl)及 a₂ 巨球蛋白（a₂ macroglobulin，a₂M)的巯酯键断裂产物明显增多。一些ITlHs 可以稳定ECM,在正常对照组中发现激肽释放酶将ITIH4 断开，而丙型肝炎肝硬化患者血清中的1TIH4明显减少提示 肝硬化时澈肽释放酶减少，这点与Nagaoka等M的发现符 合。故ITIH4的明显减少与肝硬化相关。Apo L,与高胆固醇

血症有关，而病毒性肝炎肝硬化时会发生低胆固醇血症，与 此研究中肝硬化患者Apo L,的明显缺失相符，提示Apo 的明显减少与肝硬化相关。CD5L的增多可能与丙型肝炎病 毒感染有关，而非肝硬化，因为丙型肝炎的病毒载量与CD5* B细胞的扩增成正比。p₂GPl与乳糜微粒有关，肝纤维化后 肝细胞对乳糜微粒摄取的减少可能导致循环中p₂GPl结合 乳糜微粒增加，这个假设首先提示P₂GP1的浓度增高与肝 纤维化相关。a₂M浓度的增高已确定与肝脏纤维化有关，但 如果能结合考虑巯酯键断裂产物则更有助于对肝纤维化的 诊断。

瞬时弹性测定

瞬时弹性测定（transient elastography，FibroScan; Echo- sens, 法国 巴黎） 是通过脉冲回波器发射的超声波来测定肝 脏的僵硬程度1^|81。将超声探头置于肝右叶上方的肋间隙，随 后由探头发射出的低振幅低频率弹性波进人肝脏组织进行 传播，同时脉冲回波接收器测定弹性波的传播速度，将其以 kPa为单位，所得测董值与肝脏的硬度直接相关。正常肝硬 度范围在4~6 kPa，而肝硬化大多>12 kP_ai^1M1〗。

瞬时弹性测定评估的肝脏面积相当大，约lcmx4 cm, 比肝穿刺的取样大100倍，并且可多次取样，因而进一步扩 大了取样范围，减小了肝穿刺引起的取样误差。瞬时弹性测 定对肝纤维化具有相当高的灵敏度和特异度，能鉴别正常 肝脏与肝硬化，且测M值不受性别、身高和体重影响，但也 有一定的局限性，如由于弹性波穿透深度(25~65 mm)有限， 腹壁脂肪丨体质量指数（BMI)>28]及腹水会影响其准确性而 造成误差甚至测量失败，且肋骨可能阻碍信号的传导，近期 Millonig等M报道胆汁淤积可能也是另一个影响因素。目前， 对瞬时弹性测定的研究仍有很多需进一步探讨，如参考范 围仍须进一步明确，不同病因的肝硬化可能会有不同的临 界值，临界值从乙型肝炎肝硬化的9 kPa到丙型肝炎肝移植 后再发丙型肝炎肝硬化的26.5 kPa均有报道另外发现瞬 时弹性测定的优势在于排除肝硬化（临界值14 kPa),对纤 维化程度的判断不理想，故单独使用瞬时弹性测定对临床 诊断的价值有限。瞬时弹性测定对H静脉（门脉）高压的预 测仍不明确。在所有肝内病变引起的肝脏疾病中，门脉高压 最初均由肝内阻力升髙引起。然而，随着门脉高压的进展， 内脏循环中血流#乱使门脉高压加重。因此，可以推测出瞬 时弹性测定能预测肝窦效应细胞活化引起的肝内血管阻 力的变化，但其不能测定门脉高压所特有的复杂血流动力 学W。已有多项研究将瞬时弹性测定所测值与门脉高压进行 比较，发现当肝静脉压力梯度(HVPG)<10mmHg(l nun Hg =0.133 kPa)时，肝纤维化的进展与门脉高压的增高呈正相 关，而当HVPG>12 mm Hg时，门脉高压的持续与恶化取决 于其他因素，如高动力循环、肝外门体分流及疤痕组织的收 缩。由此,瞬时弹性测定可能不是一个能评估门脉高压并发 症的有效方法。同时，瞬时弹性测定对食管静脉曲张的预测 现仍存有争议P⁵¹。

磁共振弹性成像

磁共振弹性成像(magnetic resonance elastography, MRE) 是对肝脏多个层面进行分析的三维成像技术，置于背部的 探头向肝脏右叶发射65 Hz的低频纵波，在肝内转换为剪切 波，其在肝内传播后形成的相位图经图像处理后可估算出 局部剪切波的波长，由于肝脏的弹性与该波长相关，故而可 获得弹性模量的量化值。MRE不仅能测定整个肝脏的弹性， 还能对肝脏的形态及灌注进行检测，因此可帮助发现肝癌 和脂肪肝，另外还能评估肝功能。

Huwart等_对141例肝穿刺患者（年龄为22〜83岁）进 行研究，结果显示MRE对肝纤维化的临界值为2.4 kPa,灵 敏度为85%，特异度为91%,阳性率为97%,阴性率为64%, 且MRE对肝纤维化的判断除了肝纤维化程度外不受其他 因素（如腹壁脂肪、腹水及肝纤维化病因）影响。研究中比 较了 MRE、瞬时弹性测定与AST/血小板指数（aspartate aminotransferase to platelets ratio index，APRI )，发现 MRE 比 一维成像的瞬时弹性测定局限性小、可重复性高，对肝纤维 化程度的判定比瞬时弹性测定、APRI以及瞬时弹性测定联 合APRI的准确性都髙。但是MRE也有一些缺点，如由于信 噪比的局限性，肝脏铁超负荷的患者不能用MRE检测，另 外,MRE检测所需时间比瞬时弹性测定长且费用较高。

结 语

由于肝活检的有创性带来风险，近年发展了许多检测 肝纤维化的非损伤性方法，包括血清学的和物理学的。目 前，国外对这些方法研究较多,研究对象多为酒精性肝病和 慢性丙型肝炎，而对慢性乙型肝炎所致肝纤维化的研究甚 少，但后者却正是我国肝硬化的主要病因。不同肝纤维化病 因、性别和年龄可能会导致不同的临界值，因而以上这些非 损伤性检测方法的广泛适用性或临界值范围仍有待进一步 验证。另一方面，非损伤性方法对肝纤维化程度的分期不如 肝活检直观明确，正如美国胃肠病学会所阐明的，“任何临 床或实验室指标，单独或联合，都不能准确判断肝内坏死性 炎症或肝纤维化的程度。因此，尽管存在取样误差，肝活检 仍然是决定组织学分级与分期的‘金标准’。预行抗病毒治 疗的患者可通过肝活检评估肝脏的现状及预测疾病将来的 进展情况”网。但是随着非损伤性检测方法的发展和完善，肝 活检有望在诊断肝纤维化方面被这些新技术所取代。

成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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