肝纤维化动物模型制备的常用方法及其MRI检测的研究进展与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

【摘要】成都华西华科研究所研究制备良好的动物模型是科研过程中的重要环节。制作肝纤维化动物模型的化学方法中最常用的主要有四氯 化碳（CC14)法和硫代乙酰胺（TAA)法，该方法造模简单、成模率高，物理方法中主要为胆管结扎法，该方法操作复杂、成 模率较低，但对其他组织器官无毒性作用。在磁共振检测的研究中，弥散加权、灌注成像及波谱成像能够对中重度肝硬 化作出分期，但对轻中度肝纤维化分期尚有明显不足，而弥散张量成像在轻中度的肝纤维化的诊断中有较大优势。现就 制备动物肝纤维化模型的常用方法及该模型MRI检测的研究方法的进展进行综述。

【关键词】肝纤维化；动物；模型；磁共振成像

肝纤维化为肝硬化早期出现的病理改变，因此如何有 效早期诊断和防治肝硬化成为人们研究的热点。随着对肝 硬化研究的不断深人，有学者明确提出肝纤维化可以逆转的 观点^[1]，所以早期肝硬化的检测显得非常重要。目前，肝组 织的病理学检测仍然是确诊肝纤维化和肝硬化的金标准，然 而该方法有创、局部取材并且其检测结果受病理学医师经验 的影响。随着科技不断的发展B超、CT、MRI等影像学检查 方法取得飞速的发展。作为无创、无辐射的检查技术中的一 种，磁共振检査不但能够显示肝脏的形态学变化，而且能够 反映肝脏的代谢状况。肝硬化动物模型的建立为其影像学 研究提供材料，理想的肝纤维化模型往往决定着研究检测的 结果，本文综述家动物肝纤维化造模常用方法及家兔肝纤维 化模型的MRI的研究，以期为科研和临床提供参考。

1制备肝纤维化模型常用方法

1.1四氯化碳诱导肝纤维化模型

目前，四氯化碳（CC14)诱导肝纤维化的方法仍为最经典 的方法。在体内CC14通过细胞色素P450氧化酶生成自由 基从而使肝细胞死亡，该方法具有成模率髙、可重复性好、方 法简单等特点，但是该方法死亡率较高。可能与动物个体的 差异或剂量掌握不当有关。常用的四氯化碳诱导法有皮下 注射、腹腔注射和灌胃法。：^3₁1心_〇等^[2]给予家兔苯妥英钠 两周后进行CC14灌胃，并根据AST、ALT的水平对CC14的 剂量进行调整，于16周得到良好的肝硬化模型，其成模率达 80%。Chow AM等^[3]用体积比1:3的CCL4-橄榄油溶液以 5pL/g的剂量每周两次对小鼠皮下注射，于8周后获得良好 肝纤维化模型。郭丽丽等^[4]通过实验研究，每周两次皮下注 射50%CC14 —橄榄油溶液，前两周剂量为0. 3ml/kg，第3周 开始剂量增加至〇. 4ml/kg，结果发现在第12周形成了较好 的肝硬化模型，并且死亡率仅为8.3%，适用于实验研究。对 于小鼠的肝纤维化模型，孙晓飞等^[5]通过不同浓度的CCL4 腹腔注射，实验表明应每周两次腹腔注射30%CCL41ml/kg能获得良好的肝纤维化模型，然而，有研究表明CCL4诱导 的肝纤维化模型有一定的自愈性^[6]，即当制作出良好的肝纤 维化模型停用CCL4后，动物的肝纤维化改变逐渐恢复。腹 腔注射和灌胃法死亡率之所以比皮下注射法高可能因为前 者对CC14吸收较快从而造成急性肝损伤。即便相同给药途 径下，动物死亡率有较大差异可能为给药剂量的不同和动物 的个体差异所造成的。

1.2硫代乙酰胺诱导肝硬化模型

硫代乙酰胺(TAA)进人肝脏后延长肝细胞的有丝分裂， 并且阻碍RNA从细胞核到细胞质的转移，进而影响依赖酶 的代谢过程，最终形成肝细胞坏死。肝实质的破坏引起肝间 质内结缔组织的生成增多，从而引起纤维组织的在局部的沉 积。其形成的动物模型在血流动力学、形态学及功能上的改 变均与人慢性肝病相似。制备硫代乙酰胺肝硬化模型时有 喂养和腹腔注射两种发法，其中喂养法最为常用，Yang YL 等「^7]以浓度1. 2g/L的硫代乙酰胺作为唯一饮用水建立肝硬 化模型，在第16周制作出良好的肝硬化模型，该模型具有造 模方法简单、死亡率低等特点，由于其肝硬化改变与人肝硬 化相似而适于临床基础的研究。Shi Y等^[8]每周两次对家兔 以lml/kg皮下注射4%TAA溶液，在20周内形成良好的各 期肝纤维化模型。王鹤桦等^[9]通过皮下注射硫代乙酰胺制 作成良好的兔肝纤维化模型，该模型用生理盐水配制好5% 的硫代乙酰胺进行皮下注射，首次注射剂量为1. 5ml/kg，以 后改为1.0ml/k_g，每周两次，并根据兔的精神状态和体质量 状况调整剂量，于第12周获得良好的肝纤维化模型。该模 型成模率较高，适用于肝纤维化的基础研究。

1.3胆汁型肝纤维化模型

本模型通过胆总管的结扎，形成人为的肝外胆道梗阻， 进而肝细胞缺血和坏死，胶原组织大量沉积，向肝小叶内伸 展，包围肝小叶并散布于肝细胞周围，逐渐形成肝硬化。国 内外学者对啮齿类动物胆管结扎进行肝硬化造模已较为成 熟^[1°〜^12]，刘迎春等^[i3]通过对SD大鼠麻醉后分离胆管，以丝 线结扎胆管于6〜8周建立了良好的肝纤维化模型，并且胆 汁淤积性肝纤维化模型具有形成周期短、形成的纤维化稳定 可靠、实验中没有对实验者和动物有毒物质的接触等优点。 对于兔胆管结扎建立肝纤维化模型的报道相对较少，国外学 者研究发现通过结扎胆管，家兔在四周左右肝组织出现纤维 化改变^[14]，付山峰等^[15]通过将胆总管与不同直径的硬塑料 管一同结扎，结扎后将硬塑料管抽出，形成胆总管部分结扎 而建立胆管阻塞型兔肝纤维化模型。该实验发现，当胆管完 全结扎时，兔于1天后死亡，说明不耐受胆管完全结扎。并 发现所用塑料管直径在1. 〇mm以上时能获得较好的肝纤维 化模型。虽然此方法不涉及对肝脏的毒性作用，对肝纤维化 动物生化指标不会造成影响，是研究肝纤维化病理生理和药 理的理想模型之一，但是制作该种模型操作复杂，对术者外 科操作有一定的要求。

1.4其他

由刀豆蛋白ACCona A)诱导的肝纤维化模型是一种由 530

免疫细胞介导的肝纤维化模型。刀豆蛋白A是一种T细胞 活化剂，可以活化T细胞，引起T细胞介导肝损伤^[16]。由 Cona A诱导的肝纤维化动物模型在病理学改变与人类 HBV引起的慢性肝病所表现出的肝纤维化较为相似^[17]。 Whal C等^[18]通过大鼠尾静脉注射Cona A后成功诱导出肝 炎模型；梁洁等^[19]通过同样的方法多次注射Cona A来诱发 免疫细胞介导的肝损伤最终进展为肝纤维化，建立出良好的 肝纤维化模型。在科研过程中，很多学者应用多种刺激因素 进行干预来获得良好的肝纤维化模型。单因素造模时间长， 成功率相对较低，联合多种造模因素造模，不仅缩短造模时 间，还能够提高造模成功率。Roland等^[2°^]通过每周两次联 合皮下注射lOmg乙烯雌酚和给食2%胆固醇，12周时间能 够制作出良好的肝纤维化模型。因此，通过不同途径适当增 加对动物的损伤性刺激，能够提高动物模型的成功率。

2肝纤维化模型MRI研究常用方法

2. 1扩散加权成像

MRI扩散加权成像（DWI)是以突出水分子的弥散效应 作为图像对比的一种成像方法，是目前唯一种检测活体组织 水分子热运动的技术。通过添加弥散敏感梯度脉冲，使运动 的水分子产生相位离散、信号降低，而静止的水分子信号强 度不受影响，因而水分子运动越自由的组织信号强度降低越 明显。DWI正是通过检测组织内水分子的运动状态来反映 组织内的结构特点。在扩散加权成像中最常用的指标是 ADC值，即表观扩系数，它反映了水分子的热运动。在DWI 的序列设置中b值（扩散敏感度）的选择是非常重要的，b值 的选择是影响DWI中信号强度和ADC值的主要因素，在 DW1中b值越小受到组织微灌流的影响越大，b值越大越能 真实的反映组织中水分子的弥散特性。但是随着b值的增 大各种伪影逐渐增多，图像易变形，信噪比下降，严重影响图 像质量，因此选取恰当的b值能够获取高质量的图像时使 DWI能正在的反映弥散。国外学者研究最多的为鼠类，Bar­ry B 等^[21] 通过采用纹理分析的统计方法对小 鼠肝纤维化模 型的弥散加权图像进行分析，他们通过直方图三个特性（平 均数、中位数及标准差）、五灰度共生矩阵（gray-level co-oc­currence ， GLCM) 及 十一灰度游程 （gray-level run-length ， GLRL)的特征评估肝纤维化ADC值与肝纤维化图像分析的 相关性，研究发现ADC值的中位数与肝纤维化图像分析所 得出的评价具有很强的相关性（R = -〇. 89)，而ADC标准差 与其具有中度相关性（R = 0.70)。王秋实等^[22]在兔肝纤维 化的弥散加权成像的研究中发现在b值取300、600s/mm² 时，随着肝纤维化程度加重ADC值依次降低，说明随着肝纤 维化的出现和程度增加，肝脏组织内的水分子受限、弥散减 弱，与肝纤维化的病理学基础一致。并且在b值取300s/ mm²时ADC值能有效的将轻中度纤维从正常肝脏和重度 肝纤维化/肝硬化中鉴别出来，认为DWI成像有助于检测早 期肝纤维化。然而杨正汉等^[23]通过对犬半肝肝硬化模型的 DWI的研究中发现，轻度肝硬化的ADC值没有明显的改变， 认为ADC值并非反映肝硬化的明显指标。并且认为严重肝

医学影像学杂志2015年第25卷第3期 J Med Imaging Vol. 25 No, 3 2015

硬化可以使肝组织的ADC值降低不是由增生的纤维组织本 身限制了水分子的热运动，而是由于纤维增生影响了肝脏微 循环导致肝实质内血流灌注减少所致。

2.2弥散张量成像

磁共振弥散张量成像（DTI)是在DWI基础上发展起来 的MR技术，其成像基础为活体组织中不同结构导致水分子 自由弥散的速率和方向发生改变，并可转为图像和各参数。 ADC值和FA值分别反映生物体内水分子的运动能力和运 动方向，ADC值与水分子的运动能力成正比，FA值与水分 子运动方向一致的程度成正比。磁共振扩撒张量成像在肝 纤维化方面的研究报道甚少，Lee Y等通过对小鼠肝纤维 化模型检测认为，相对于通过弥散加权得出的ADC值，弥散 张量所得出的FA值对轻中度的肝纤维化更为敏感。章雅 琴等^[25]对犬肝硬化模型进行MR-DTI检测，随着肝纤维化 的进展，ADC逐渐降低（P <0.05)，FA值总体呈上升趋势 (P >0. 05)，肝脏组织病理学分期S2〜S4期ADC值与对照 组、S1期比较差异有统计学意义，S4期ADC值与S2期比较 差异有统计学意义。随着肝纤维化程度的加重，FA值总体 呈上升趋势，二者呈正相关，但不同纤维化间差异无统计学 意义。该研究认为，MR-DTI能够反映肝硬化各期的血流动 力学变化趋势，ADC值与肝纤维化程度具有良好的相关性， DTI可作为检査肝纤维化较敏感的手段。Cheung等^[26]对未 注射CC14和注射CC14两周、四周的SD大鼠进行MR-DTI 检测，结果显示，两者的ADC值有明显的差异，而FA值在 注射前与注射两周后有显著差异，但是在注射后第四周发现 其FA值又趋于注射前水平，因此该研究者认为磁共振张量 成像对肝纤维化早期的诊断有较大价值。

2.3磁共振波谱成像

磁共振波谱成像技术（MRS)是以磁共振成像基本原理 及和化学位移和自旋耦合现象为基础来定量测定活体组织 器官生化改变及代谢状态的一种无创性的功能成像技术。 脑肿瘤对于波谱的成像技术的研究最为广 和³¹P-MRS的研究较多。在肝脏中含有氢质子的代谢产物， 在质子磁共振波谱研究中大多研究主要的含氢复合物，脂质 (lipid)、胆碱（Cho)、糖原/葡萄糖复合物（Glyu)。在王秋实 等^[29]死兔肝纤维化模型的磁共振波谱研究中发现，Cho/lip- id、Glyu/ lipid随肝纤维化的程度的增加而增加。然而只有 Cho/lipid在重度肝纤维化/肝硬化组与无肝纤维化和轻中度 肝纤维化有统计学意义。因此，尚不能通过氢质子磁共振波 谱区分无纤维化和轻中度肝纤维化。Cho 30等^[3°^]对75位 慢性肝病志愿者的研究表明，随着肝纤维化程度的增加，代 谢物与脂质的比值升高，其升髙的程度与肝脏组织病理学改 变的程度一致，因此iH-MRS可能将在慢性肝病的诊断和分 级中代替肝脏病理学检查。对P-MRS的研究报道甚少。在 不使用去耦合技术时，正常肝脏的³¹ P波谱主要由三磷酸腺 苷（ATP)、无机磷（Pi)、磷酸单脂（PME)和磷酸二脂（PDE) 等几个主要的波峰组成。在肝脏的代谢过程中，ATP和Pi 反映了细胞的能量代谢和酸碱平衡，PME和PDE则反映细

胞磷脂合成与分解代谢过程中中间产物的水平。在肝脏病 变过程中上述指标将发生相应的变化，因此³¹P-MRS能够揭 示肝脏病变的生化变化，有学者认为PME/PDE是检测肝硬 化的敏感指标^[31]，可利用该指标将对轻中度肝纤维化与肝 硬化进行E分。

2. 4灌注加权成像

MR灌注加权成像（PWI)用来描述血流通过组织血管网 的情况，通过测量血流动力学参数，来无创的评价组织的血 流灌注状态。根据成像原理，PWI分为对比剂首过法和动脉 自旋标记法。而前者更常用于实验和临床中。胡晓峰等^[32] 对36只家兔肝硬化迨模后，通过采集肝实质和门静脉的信 号强度计算出相对肝门静脉局部血流容积、相对肝门静脉局 部血流量、平均通过时间、最大信号下降百分比和相对肝血 流容积，结果显示最大信号下降百分比在各组间有显著的统 计学差异，而其他各组参数显示有相对减少或增加的趋势， 但没有统计学差异，因此认为用该方法不能对肝硬化模型进 行肝纤维化分期。曾燕等^[33]通过磁共振灌注加权成像对兔 肝硬化模型量化分析门静脉和肝实质的峰值时刻、达峰时 间、信号上升最大斜率和最大相对信号增加率的变化规律， 分析显示轻度肝纤维化与中重度肝纤维化的上述指标的差 异有统计学意义，提示门静脉灌注参数可能反映轻度肝纤维 化和中、重度纤维化或早期肝硬化的门静脉血流动力学改 变。因此认为磁共振的灌注加权成像能够对肝纤维化的程 度进行量化评估。综上所述，应用磁共振的灌注加权成像对 不同程度肝纤维化模型进行观察，随着肝纤维化程度的增 加，各种检査指标与之有一定的相关性，在轻度和中重度纤 维化中的各个指标的差异并没有统计学意义，因此目前通过 该检査方法我们尚不能对肝硬化进行细致的分期。目前 PWI操作技术相对复杂，且不能准确计算组织内对比剂的总 量，因此要得到良好的灌注图像及较为准确的血管的灌注量 需要进一步的研究及实践。

动物模型的制备已经是现在生命科学研究中不可缺少 的环节 <=理想的肝硬化动物模型应该与人类肝脏病变具有 相似的发生发展转归的疾病特征；其病变应该有明显的病变 分期从而利于病变过程的归纳和分析；制备动物模型的方法 应该简便易行，在制备出合格模塱的前提下保证生存率。对 肝纤维化的磁共振成像诊断的研究仍处于初级阶段，在肝纤 维化实验研究中，磁共振成像在中晚期肝硬化的区分中有较 明显的优势，在区分轻中度的肝纤维化中尚有明显不足，未 来的研究应该着重确定一个肝纤维化分期的诊断标准。随 着计算机技术的发展，磁共振的功能不断完善，功能成像将 发挥更重要的作用。

成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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