细胞及金属蛋白_与肝内基质降解与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

近年来.随着医学分子生物学的发展，有关肝纤维 化发生机制的研究有了长E的进步，目前认为肝纤维化 主.要是由于細抱外基®( extracellular matrix - ECM 1合 成与降解平衡失调，导致ECM异常增多与过®沉积而 形成的■■而Ito细明I在肝内ECM代谢方面起到重要作 用„激活的Ito细胞不仅饍够合成ECMt主要是I a和 1 S胶原而且〗to鲴咆在肝脏损伤或纤维化时可由 静态转化为肌成纤维样细瞄，合成一组能够降解ECM 的酶系-基质金厲蛋白酶 (mBtrix nietBllciproteinBses * MM JPs J 及其组织抑制因子（tissue inhibitor of met alio prote'tnases, TIMPs),#与调节肝内ECM的降解，

本文将就Ito细胞与MMPs及TIMPs的关系和它 们在正常肝内及纤维化肝内ECM降解中的作用作一 介绍-

1 Ito细明的结掬与功_

h〇细狍又名贮脂细胞、窦周细胞•星形鲴咆等.位 于肝内窦周间除，即Disse腔除*约占肝内细胞总数的 5W〜]5%.其分布广泛，形态不规则，常伸出数个星状 突起，胞质内有许多大小不等的瞻滴-Ito细胞的主要功 能之一是贮存_生索A,肝内Ito絪瞄贮存_生素A的 量比肝细胞高300倍.静¹态戒激活状态下的tto细胞具

有合成和分泌多种胶原蛋白的功齙.参与肝脏的生物代 谢活动。另外.它还可以分泌多种细咆因子，如HGF(肝 鲴咆生长因子hTGFft〔转移生长因子等，通过自 分泌及旁分泌机制发挥效应<■研究表细咆是肝 内ECM主要来源₌阑代培养的It_〇细咆可合成1,1、 h，V型胶原，层粘蛋白.纤_连接蛋白及多种蛋白多糖 等ECM。屎位杂交法证明X,在肝纤_化动物模S中， 多种简质胶原mRNA表达主要集中于激活的h_〇细 胞。在肝捆伤及TGF-扎作用下*Ito细胞可增殪活化*失 去脂肪小滴，变为肌成纤S样细咆，合成大*EC\^同 时在一定条件下，静止或激活的Ito细胞也飽合成某些 MMPs及TIMPs,#与肝内ECM的降解₃ 2金屑霣白酶系及其活性谓节

参与ECM降解的金*蛋白酶是一组具有Zn^;+依 教性的内源性霣白薅，对多种ECM成分具有选择性和 特异性^['目前该醻系已有15组基因*鶚定并克巉，按 底物不同可分为4组：①胶庳分为间塊胶瘅酶 (MMP-I〕、中性粒鲴胞皎匣酶（MMP-8K3型皎瞋酶 (MMP-]3)„主要可降解]，I、1型胶原t②明眩1SHW 型胶原醻），分为明皎酶At72kD,MMP-£)和明胶酶B W2kD,MMP-9>,可降解*底_胶m(W型）及变性R頭

肝纤维化的诊断研究

【摘要】肝纤维化是机体对慢性肝损伤的修复反应，见于大多数不同病因的慢性肝脏疾病中。早期肝纤维化是可逆的，因此，正确 评估肝纤维化的程度和进展显得十分重要。关于肝纤维化的诊断的研究也越来越多，有助于逆转肝纤维化以阻断慢性肝病-肝纤 维化-肝硬化-肝癌这一进展过程。本文就血清学指标、影像学检查及肝穿刺活检技术在肝纤维化诊断中的研究作一概述。

【关键词】肝纤维化;诊断;血清学；影像学

肝纤维化是肝组织内细胞外基质成分（extracellul­ar matrix,ECM) 过度沉积导致的肝结构和功能异常的 病理变化。近几十年来，随着分子生物学的发展，进一 步阐明了肝纤维化的发生发展，并证实了早期肝纤维 化是可逆的，因此，肝纤维化的诊断对阻断慢性肝病- 肝纤维化-肝硬化-肝癌这一进展过程有重大意义。

1血清学指标

近年来发现血清学指标与肝纤维化之间有良好的 相关性，通过血清学指标的联合检测可对肝纤维化进 行早期诊断，并可进行动态观察，从而调整治疗策略。

1.1    反映ECM合成的指标

1.1.1          透明质酸（hyaluronic acid，HA):是 ECM 的成 分之一，由间质细胞合成，主要反映肝窦内皮细胞的功 能。有研究表明以90 ng/ml为界值，HA诊断肝纤维 化的特异度为92%，敏感度为55% ,与PHI P联合检 测，可较准确的判断肝纤维化^[1]。此外，HA可预测诊 断儿童肝纤维化及非酒精性脂肪肝^[2]。HA水平与肝 内胶原沉积量的相关系数约为0.6,如与LN、PIEP、

基金项目：中国肝炎基金会王宝恩肝纤维化研究基金（20120147) 第一作者简介：张婷婷，在读硕士，研究方向：中医内科、慢性肝病。 E-mail：zhangting8146@163. com

通讯作者：吕文良，博士，主任医师，研究方向：消化系统疾病的临床研 究以及肝病的临床和实验研究。E-mail:lvwenliang@sohu. com

CIV联合检测评估，则相关系数可高达0. 93^[3]。

1.1.2 IV型胶原（collagen IV, CIV):分布于肝窦内皮 细胞下，是构成基膜的主要成分。CIV与LN有高度的 亲和性，过度沉积使“肝窦毛细血管化”，肝窦组织结 构和肝血流改变，使肝细胞营养受限，从而加剧肝脏病 变。现认为，在肝纤维化早期已有CIV的沉积，故CIV 可以作为反映早期肝纤维化的指标，对肝硬化和肝纤 维化均有较高的敏感度和特异度^[4]。彭婕等^[5]兔肝 纤维化模型的实验研究结果显示血清学指标可以反映 肝纤维化的严重程度，其中以CF的价值较高。

1.1.3层黏连蛋白（laminin, LN):是一种非胶原性结 构性糖蛋白，在正常肝脏中LN与CIV等共同构成基底 膜。肝硬化患者肝功能愈差，其血清值愈高，提示肝脏 对它的降解减少，故此指标可反映肝窦毛细血管化和 汇管区纤维化^[6]。此外，有研究表明LN与肝纤维化 程度和门静脉高压呈正相关^[7]，肝纤维化后期升高尤 为显著。

1.1.4纤维连接素（fibrcm_ecti_n，FN):在肝脏，所有细 胞外间隙都可测到FN,早期肝纤维化形成时，血浆FN 明显升高，出现在其他ECM沉积之前。研究表明肝脏 炎症活动度及纤维化程度与FN呈正相关^[8]。

1.1.5 DI 型前胶原（procollagen IE，PC EI ):是 HI 型胶 原的前体,PC IE是成人肝纤维化活动的良好指标，动 态观察pcni可以判断肝纤维化的程度。pcm诊断肝胃肠病学和肝病学杂志 2013 年 10 月第 22 卷第 10 期 Chin J Gastroenterol Hepatol, Oct 2013, Vol. 

硬化的阴性预测值为91.3% ~93.2%，因此，在排除 肝硬化方面有一定的应用价值^[9]。

1.1.6          IE型前胶原氨基末端肽（amino terminal of pro­collagen type 皿 peptide ， P m P ) : PC BI 受 到肽酶 切割分 离，成为m型胶原和pdip。血清pdip含量能可靠的 反映肝纤维化的程度和活动性及肝脏的组织学改变。 大量研究发现血清PIHP升高要明显早于形态学观察 到纤维增生，是早期反映肝内纤维化的特异性指 标⑴。P1EP是ECM的主要组成成分，可反映M型胶 原合成速率及含量，与肝纤维化活动度具有良好的相 关性¹¹°」。

1.1.7          脯氨酸经化酶（prolyl hydroxylase，PH):是胶 原纤维合成酶，作用于胶原合成的早期阶段，能将胶原 ct-肽链上的脯氨酸羟化为羟脯氨酸。肝纤维化时肝脏 胶原纤维合成亢进，血清中PH增高。PH活性与肝细 胞坏死和纤维化程度呈正相关，所以PH测定也是肝 脏疾病疗效评估和预后判断的指标。

1.2反映ECM降解的指标

1.2.1          基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMPs)及其抑制物（tissue irhibitor of metalloproteinase, TIMPs) :MMPs是一组结构与功能同源的锌离子依赖 性蛋白水解酶超基因家族，其中MMP-1为间质胶原 酶，主要降解I、1型胶原，MMP-2为明胶酶，主要由 激活的HSC分泌，主要降解正常肝脏的基底膜。 TIMPs为抑制MMPs活性的糖蛋白，肝脏中仅存在 TIMP-1和TIMP-2。肝脏ECM的代谢主要由MMPs及 TIMPs共同调节，MMPs促进ECM降解，而TIMPs通过 抑制MMPs阻止ECM降解，从而形成或促进肝纤维 化。此外，TIMPs还通过抑制HSC凋亡从而促进肝纤 维化的持续发展^[11]。颜玲等^[12]实验结果显示肝纤维 化模型组大鼠肝组织内胶原降解相关酶MMP-1的表 达显著增加，但肝纤维化没有逆转，因为肝纤维化时 TIMP-1表达增加，与MMP-1形成复合物，使MMP-1失 去降解ECM的作用。也有文献报道，大鼠免疫性肝纤 维化的形成原因可能并不是MMP-1的表达逐渐减少， 而是TIMP-1进行性升高使MMP-1受到抑制，因此可 以推测在肝纤维化形成中TIMP-1起主要调节作 用^[13]。陈江等^[14]实验建立的大鼠肝纤维化模型中， MMP-2合成持续增高，而TIMP-2无显著改变，说明 MMP-2与肝纤维化程度相关，在肝纤维化的形成和逆 转中具有重要作用。综上所述，]\^?₃和TIMPs在肝 纤维化形成和逆转的动态平衡中起重要作用。

1.2.2          脯氨酸肽酶（pn>lid_as，PLD):目前较多认为 PLD与炎症和纤维化都有关。在肝炎时与ALT同时 升高，可能与炎症、坏死有关，在肝硬化时PLD增高而 ALT正常，则可能与肝纤维化有关。其诊断肝纤维化 的敏感度达90%，但特异度仅60% ^[6]。

1.3细胞因子

1.3.1          血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF) :PDGF在肝脏中主要由血小板、库普弗 细胞、肝窦内皮细胞产生，PDGF是目前已知体外HSC 最强的促细胞分裂因子。PDGF由A、B两条肽链组 成，以 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB 三种形式存在， 通过受体介导起作用。其中PDGF-BB与HSC表面的 PDGF受体有较强的亲和力，故PDGF-BB与肝纤维化 关系密切^[15]。此外，PDGF-BB促进肝纤维化与其引 起HSC表达组织TIMP-1增强有关，在体内可能与 TIMP-1共同发挥作用。说明PDGF可能通过增力口 TIMP-1水平而抑制胶原酶作用从而减少ECM的 降解^[16]。

1.3.2          转化生长因子 p (transforming growth factor (3 , TGF-p):是一组重要的生长因子家族，其中TGF-(31就 是强效致纤维化因子，促进ECM的合成，抑制ECM降 解；改变MMPs及TIMPs的活性,从而推动纤维化不断 进展。有研究显示，TGF-pl的表达与肝纤维化分期呈 正相关^[17]。

1.3.3          肿瘤坏死因子 a( tumor necrosis factor ct，TNF- c〇 :是一类由单核-巨噬细胞产生的内源性细胞因 子。可促进肝内Ito细胞及纤维母细胞増殖，并对纤维 母细胞及Ito细胞的胶原起促进作用。李惠珍等^fl8]的 研究表明TNF-_a水平随着纤维化程度的加重而升高， 且TNF-_a在炎症反应和纤维化启动时起重要作用，可 作为肝纤维化的血清学指标。

上述均为反映肝纤维化的直接血清学指标，肝纤 维化的间接血清学指标包括与肝功能相关的实验室检 查，如人1^、灰31\人31'/人1^、7-谷氨酸转肽酶（7-〇1')、 碱性磷酸酶（ALP)、白蛋白（ALB)、凝血酶原时间 (PT)、血小板计数（PLT)等。AST水平与肝组织病 变，尤其是肝纤维化进展之间有很好的相关性，随着病 变逐渐进展，AST/ALT比值大于1，常被用来预测重度 肝纤维化。将7-GT作为肝纤维化指标的报道不少， 且7-GT的预测价值不受胆红素和转氨酶水平的影 响™。PT不仅是单纯外源性凝血系统的实验室指 标，也是反映肝脏病变严重程度的重要指标，与肝纤维 化的程度呈正相关^[2°^]。PLT减少和ALB合成减少往 往见于晚期肝纤维化患者中，因此，建立纤维化诊断的 血清学模型如APRI、Fibrolndex、Frons等以提高诊断 水平。

2影像学检查

随着科学技术飞速发展，现代医疗科学技术及设 备日益先进，各种成像技术对肝纤维化的诊断能力也 有了进一步的提高。近年来应用的瞬时弹性超声（fi- broscan，FS)、实时超声弹性成像（real time elastosonog-

胃肠病学和肝病学杂志 2013 年 10 月第 22 卷第 10 期 Chin J Gastroenterol Hepatol, Oct 2013, Vol. 22, No. 10

raphy,RTE)和磁共振弥散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI)已对肝纤维化的诊断有较高的准确性， 且操作简单、患者依从性良好、可进行动态随访观察， 具有一定的临床应用前景。

2.1 瞬时弹性超声（FS) FS是由法国Echosens公 司制成的测定肝组织弹性的专用仪器。FS是应用一 维脉冲超声切割波在肝组织内运行的速度换算成弹力 数值，数值越大，反映弹性波的传播越快，所检测的组 织硬度越大，从而客观定量的测量与肝纤维化程度密 切相关的肝脏的硬度。李梵等^[21]通过对364例慢性 HBV感染者进行检测，获得FS检测值（FS值），FS值 与疾病严重程度相关性较好，故FS在诊断慢性HBV 感染者纤维化严重程度方面有较好的应用价值。汪春 付等^[22]研究表明，FS可协助判断慢性肝病，尤其在慢 性丙肝诊断方面意义重大，肥胖和肝脏炎症活动是影 响FS检测结果的重要因素，人群界定和时机选择是 FS检测准确性的重要因素。FibroScan像B超一样， 它最大的优点是无创，而且能够快速对肝脏纤维化作 出诊断，精确度高、重复性好，完全避免了肝穿刺带来 的创伤。FS对纤维化各期的分级诊断准确性 (AUP0C)在80%以上。但是对于中等程度的肝纤维 化而言，FS仍不能准确地加以区分^[23]。

2.2实时超声弹性成像（RTE) RTE作为一种新兴 的无创性检测手段已逐步运用于肝纤维化的诊断。有 研究应用RTE测定肝纤维化各期肝组织/肋间肌肉组 织的应变比，得出应变比1. 10作为诊断肝明显纤维化 的最佳诊断界值，其敏感度为86. 84% ,特异度为82.00% , 阳性预测值为78.57%，阴性预测值为89.13%，表明RTE 应变比指标是定量诊断肝纤维化严重程度的有效方 法，尤其对明显肝纤维化期的诊断敏感度较高，可作为 无创判断肝纤维化程度的新方法^[24]。近年来，国内外 有许多运用FS定量诊断慢性肝病患者肝纤维化程度 的报道，但受技术因素的限制，当患者体质量指数 (BMI)增高、过度肥胖、腹腔积液时，诊断的准确性会 降低。相反，RTE受上述条件的影响并不明显，且与 血清学指标相结合可提高敏感性和特异性^[25]。因此， RTE可作为无创判断肝纤维化程度的新方法。

2.3磁共振弥散加权成像（DWI) DWI应用于肝纤 维化的基础是DWI作为一种MR功能成像新技术，对 组织水分子运动敏感性高，若组织内结构出现变化，组 织内的水分子运动会出现不同程度受限。肝纤维化时 ECM过度沉积、肝窦毛细血管化和血管改建等组织结 构变化会限制水分子的扩散。关于肝脏纤维化的 DWI评价，主要集中在表观弥散系数（ADC)的改变。 Lewin等^[26]运用DWI技术发现肝纤维化患者ADC显 著低于健康志愿者，且随着肝纤维化程度的加剧，ADC 值有明显的降低。由此可见，DWI对肝纤维化评估有较高的价值。

3肝穿刺活检

肝穿刺活组织检查是确定肝纤维化严重程度的 “金标准”。肝活检组织学评估可对患者的肝脏情况 提供病变发展中的重要数据，是目前其他方法无法替 代的一项检查^[27]。近十年来肝纤维化的非创伤性诊 断取得了一定进展，仍不能取代肝穿刺活检成为“金 标准” ^[28]。肝活检诊断的准确性与样本的差异性密切 相关，样本差异是肝活检的主要局限性之一。因此，即 使缺乏特征性病变也不一定能排除疑似诊断，需要结 合临床、生化和影像学结果综合分析。但是，肝活检尚 存在诸多缺点，如肝穿刺的盲目性、肝脏病变的不均一 性、取材局限而导致误差，另外有一定的创伤性，多数 患者不愿接受，不易于反复取材进行动态观察，它的局 限性限制了其在临床上的开展。

近年来，随着实验免疫学的快速发展，血清学指标 更易于检测且无创、能动态观察疾病变化，故在肝纤维 化的诊断中越来越重要。但是，这些物质并非肝脏独 有，其他组织器官病变时这些指标也会增高，作为检测 指标缺乏特异性。再者，这些指标反映的是基质的更 新率而非累积水平，所以肝脏炎症反应明显时其值升 高，相反，若为静止期肝纤维化时其值正常，故血清学 指标并不能取代肝活检而成为诊断肝纤维化的“金标 准”。此外，肝窦内皮细胞功能异常或胆汁排泄受阻 影响血清清除率，待检的新鲜度标本、检测方法、不同 试剂盒等原因均会影响血清水平。综上所述，单纯的 血清学指标的检测会造成肝纤维化的误诊或漏诊，因 此，在血清学指标的基础上，联合影像学及组织病理学 检查进行综合诊断,结合相关病因、病程、治疗情况、临 床表现全面分析，是准确诊断肝纤维化的必然趋势，对 肝纤维化的治疗和预后有很大的临床价值。

  成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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