化学发光免疫分析法检测肝纤维化血清标志物的性能评价与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

【摘要】目的成都华西华科研究所研究验证某化学发光免疫分析系统检测透明质酸（HA)、层粘连蛋白（LN)、IQ型前胶原N端肽 (PffiP N-P)、IV型胶原（C-IY)的分析性能。方法参照相关标准文件中的方法，分别对精密度、加样针携带污染 率、准确度、线性范围和参考区间进行验证。结果批内精密度验证结果显示，HA低值为3. 38%，高值为1. 00%; 1^[低值为4.42%,高值为0.78%_;卩111?>^1³低值为4.39%，高值为0.35%_;(：-汉低值为4.42%，高值为0.40%。

批间精密度验证结果显示，HA低值为4. 49%，高值为3.86 % _;LN为低值为5. 68%，高值为3.60% ;PIHPN-P低值 为5. 98%，高值为4.05% _;C-IV低值为5. 44%，高值为3. 53%。加样针携带污染率验证结果显示，HA为0.99%₀， 1^[为一0.41沁，？111?1^-?为0.28%。，〇汉为0.53%。。各指标质控品实测值与靶值的相对偏差分别为1^八0.45%、

LN — 1.65%、PffiP N-P —0.24%、〇IV —0. 70%。线性范围验证结果昱示，HA 为 12. 84〜1 897. 76 ng/tnL，LN 为 20.98〜960.59 叩/1111^；?111?>'1-?为10.72〜1 923.48 叫/1111，(：-1¥为11.85〜1 964.49 叫/1111。参考区间验证 结果为 HA<100 ng/mL、LN<50 ng/mL、PHI P N-P<30 ng/mL、C-]V<30 ng/mL。结论该化学发光免疫分析系 统检测HA、LN、PIEP N-PX-JV的主要分析性能指标达到预期要求，厂家提供的参考区间可以接受。

【关键词】化学发光免疫分析；透明质酸；层粘连蛋白；DI型前胶原N端肽；仅型胶原；性能验证 DOI： 10. 3969/j.

肝纤维化甚至早期肝硬化如能及时发现并进行抗纤维化 治疗，均是可以逆转的。肝纤维化血清学指标检测的临床应用 极为广泛，能够为疾病诊断和患者预后判断提供重要信息^[1_²\ 通常所说的肝纤维化四项（以下简称肝纤四项）指标即最为常 用的肝纤维化血清学指标，包括透明质酸（HA)、层粘连蛋白 (LN)、III型前胶原N端肽(PIKP N-P)及汉型胶原（C-W)。目 前，化学发光免疫分析技术在上述指标临床检测中的应用已较 为广泛。本院2012年年底引进了国产化学发光免疫分析仪用 于血清HA、LN、PHIPN-P及C-F检测。根据美国病理家协 会（CAP)和IS015189文件对医学实验室的质量和能力的要 求％^4]，本实验室参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI)的

相关文件，结合通用的评价模式，对上述四个项目的检测精密 度、加样针携带污染率、准确度、线性范围、参考区间进行了验 证和评价，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1仪器与试剂公司 生产的MAGLUMI 2000 Plus型全自动化学发光免疫分析仪 及配套检测试剂（试剂批号：HA为051120714, LN为 049120904，PHIP N-P 为 052120908, CHV 为 050120907)和标 准品。可溯源至美国Sigma公司标准的LN、HA、C-IV质控品 及可溯源至美国B公司的PHI P N-P质控品，按使用 量分装，一20 °C保存。

1.2临床标本临床标本为来源于本院的新鲜血清标本，按 使用量分装，一20 °C保存。

1.3方法

1.3.1精密度分析参照CLSI EP5-A2文件^[5]，选取高低两 种浓度临床标本连续重复测定20次，计算批内精密度，以批内 变异系数)表示，最大允许CV为厂家标识CV#内的1/ 2。选取高低两种浓度临床标本连续测定20 d,每天1次，计算 批间精密度，以CV_M表示，最大允许CV_M为厂家标识CV_ 的 1/2。

1.3.2加样针携带污染率分析将高浓度标本连续测量3 次，测量值分别为H1、H2、H3;再将低浓度标本连续测量3 次，测量值分别人为L1、L2、L3。携带污染率（％) = (L1 — L3)/(H3 —L3)X100%。

1.3.3准确度分析参照CLSI EP15-A文件^[6],对可溯源的 质控品进行检测，检测结果与已知靶值进行比对，计算相对 偏差。

1.3.4线性范围分析参照CLSI EP6-A文件⑴，选取浓度 达到给定的上、下限值标准的低值标本(L)和高值标本（H)，按 照 5L+0H、4L+1H、3L + 2H、2L+3H、1L + 4H、0L + 5H 的 体积比例混合制备6个标本，每个标本重复测定3次后计算均 值。将实测值与理论值进行比较。以实测值为理论值为 X，计算回归方程：Y=aX+b，要求相关系数（r)>0. 975或 r² >0.95,斜率a范围为0. 97〜1. 03,截距b与最髙浓度比较 接近〇。

1.3.5参考区间分析参照CLSIC28-A2文件^[8]，选取20例 体检健康者(男、女各10例）临床标本，检测各指标水平后建立 参考区间，要求男、女健康者中，最多各允许有1例检测结果超 出推荐的参考区间。

2结 果

2.1精密度（1)批内精密度：批内精密度分析结果见表1。 结果表明肝纤四项的未超过5%，也未超过厂家允许 最大的1/2。（2)批间精密度：批间精密度分析结果见表 2。结果表明肝纤四项的^均未超过7.5%，也未超过厂家 允许最大的1/2。

表1肝纤四项检测的批内精密度评价试验结果

项目	标本 类型	均值 (ng/mL)	标准差 (ng/mL)	CV批内 (%)	厂家允许最大 CV批内的1/2(%)
HA	低值	54.15	1.83	3.38	5.00
	高值	1 130.06	11.31	1.00	5.00
LN	低值	34.85	1.54	4.42	5.00
	髙值	688.34	54. 36	0.78	5.00
PDlPm3	低值	20.73	0.91	4.39	5.00
	髙值	1 126.63	3.96	0.35	5.00
c-w	低值	18.57	0.82	4.42	5.00
	髙值	1 124. 64	2.28	0.20	5.00

2.2准确度可溯源的肝纤四项质控品检测及计算结果见表 3。相对偏差均未超过±2%，优于厂家允许相对偏差（士 10.00%)〇

2.3加样针携带污染率肝纤四项高浓度标本对低浓度标本 造成的携带污染率都小于厂家允许的最大携带污染率 (1.00%。），见表 4。

2.4线性范围肝纤四项线性范围评价试验结果见表5,对 应的线性散点图见图1〜4。归方程各参数（r²、a、b)如图所 示，都未超过1. 3. 4中要求的^平。计算获得肝纤四项的线性 范围如下：HA为12. 84〜1 897. 76 ng/mL，L寅为20. 98〜 960.59 ng/mL，PIIIP N-P 为 10_72〜1 923. 48 ng/mL，C-IV 为 11. 85〜1 964. 49 ng/mL。

表2肝纤四项检测的批间精密度评价试验结果

项目	标本 类型	均值 (ng/mL)	标准差 (ng/mL)	cv批间 (%)	厂家允许最大 CV批间的1/2(%)
HA	低值	54.15	2. 43	4.49	7.50
	高值	1 130.06	43.65	3. 86	7.50
LN	低值	34.85	1.98	5.68	7.50
	高值	688. 34	24. 76	3.60	7.50
PIP N-P	低值	20. 73	1. 24	5.98	7.50
	髙值	1 126. 63	45.68	4.05	7.50
c-iv	低值	18.57	1.01	5.44	7.50
	髙值	1 124.64	39.73	3.53	7.50

表3肝纤四项检测的准确度评价试验结果

项目	靶值 实测值相对偏差 C ng/mL) (ng/mL) {%)		厂家允许 相对偏差（％)
HA	562. 34 564. 89 0.45		士 10. 00
LN	343. 83 338.15 —1.65		士 10. 00
PHIP N-P	562.34 561.01 -〇. 24		士 10. 00
C-IV	562.34 558.38 — 0. 70		士 10. 00
表4	肝纤四项检测的加样针携带污染率评价试验结果
项目	H3 L1 (ng/mL) (ng/mL)	L3 携带污染率厂家允许最大 (ng/mL) (%〇) 携带污染率(％。）
HA	1 904. 74 13. 83	11. 95 0. 99	1.00
LN	971. 51 20. 56	20.95 -0.41	1.00
P0P N-P	1 919. 81 10. 95	10. 41 0. 28	1.00
C-IV	1 986. 92 12.06	11. 02 0. 53	1.00
表5	肝纤四顼检测的线性范围评价试验结果Ug/mL)
项目	标本类型	理论值	实测值
HA	5L+0H	12. 84	11. 94
	4L+1H	389.82	417.83
	3L+2H	766.81	721. 86
	2L+3H	1 143.79	1 095.28
	1L+4H	1 520. 78	1 590. 27
	0L+5H	1 897.76	1 958.83
LN	5L+0H	20. 98	18. 95
	4L+1H	208.90	197. 63
	3L+2H	396.82	419. 76
	2L+ 3H	584.75	600.04
	1L+4H	772. 67	758.75
	0L+5H	960.59	930.64

续表5肝纤四项检测的线性范围评价试验结果（ng/mL>

项目	标本类型	理论值	实测值
PIIIP N-P	5L+0H	10. 72	11.08
	4L+1H	393. 27	383.84
	3L+2H	775.82	782. 89
	2L 十 3H	1 158. 38	1 210.75
	1L+4H	1 540.93	1 570.63
	0L+5H	1 923.t48	1 894.74
c iv	5L+0H	11. 85	12. 87
	4L+1H	402. 38	389. 73
	3L+2H	792.91	780.15
	2L+3H	1 183.43	1 138.82
	1L+4H	1 573.96	1 639. 17
	0L+5H	1 964. 49	2 010.27

图1 HA线性散点图

理论值（ng/mL)

图2 LN线性散点图

理论值（ng/mL)

图3 PIEPN-P线性散点图

2.5参考区间厂家提供的肝纤四项参考区间如下：HA< 100 ng/mL，LN<50 ng/mL，PIE P N-P〈30 ng/mL，0IV〈30 ng/mL。本研究纳人的男、女性各10例体检健康者血清标本 检测结果均未出现1例或1例以上超过上述参考区间的现象，

故可以直接使用厂家提供的参考区间。

图4 C-W线性散点图

3讨 论

医学实验室将某种检测方法应用临床实际工作之前，必须 掌握检测方法的性能指标。一般情况下，仪器或试剂生产已能 够提供常用性能指标的评价结果。但是在正式检测临床标本、 发出检测报告前，医学实验室仍需对厂商提供的主要方法学性 能评价结果予以验证和确认^[9]。因此，医学实验室必须结合实 际，合理选择方法学验证试验、系统设计方法学验证方案^[1(〇。

检测系统g有良好的重复性和无携带污染是方法学评价 的前提和基本障。本研究中，肝纤四项高低浓度标本检测结 果的和CV批丨司均小于厂家允许最大变异系数的1/2。因 此，可以认为本研究中使用的化学发光免疫分析仪检测肝纤四 项的精密度是符合要求的。此外，本研究中的加样针携带污染 率分析结果也表明该分析仪的加样针携带污染对标本检测结 果的影响是可以忽略的。

准确度可以采用与已有检测系统比较、与室间质评结果比 较、与质控品或外部标准品“靶值”比较、与参比实验室比较、计 算配制溶液标本的回收率等5种形式来评估。由于肝纤四项 无国际标准品，故本研究选择可溯源的质控品进行检测，相对 偏差计算结果显示，各项指标的相对偏差均在可接受范围内， 说明该分析仪检测肝纤四项的准确性是符合要求的。

可报告范围应和线性范围一致或在线性范围内。本研究 结果显示该分析仪检测肝纤四项的线性范围是符合要求的。 临床标本检测结果若超过线性范围时，需对其进行进一步验证 后方可发出报告。超过下限时，检测结果对目前的诊疗缺乏指 导意义。超过上限时，则应在稀释标本后进行在此检测，但可 稀释的水平尚需验证。

医学实验室如果采用厂家提供的参考区间，则必须验证该 参考区间是否适用于实验室所服务的人群。本研究随机选择 了 20例体检健康者的标本进行验证，95%以上的检测结果均 在厂家提供的参考区间内，因此，可以认为厂家提供的参考区 间基本适用于本实验室。

本研究结果显示，MAGLUMI 2000 Plus型全自动化学发 光免疫分析仪检测肝纤四项的精密度、加样针携带污染率、准 确度、线性范围均符合预期要求，厂家提供的参考区间可以接 受，可用于临床标本的肝纤四项检测。

AFP浓度PLC患者的早期诊断，对PLC与慢性肝炎、肝硬化 等良性肝病的鉴别诊断具有重要意义。尤其是低血清AFP浓 度的慢性肝炎、肝硬化等良性肝病患者，定期检测、动态监测血 清AFP-L3%水平，有助于及时发现疾病的恶变倾向，尽早明 确诊断^[16]。与此同时，对于AFP-L3%>10%的肝病患者，有 必要进行定期随访和密切追踪。

AFP-L3检测方法多利用其具有与LCA特异性结合的特 性建立和发展而来，其中亲和吸附离心管法因技术成熟，临床 应用较多^[17]。本研究中采用的国产微量离心柱法试剂对在血 清AFP-L3分离纯化和检测方面具有操作简便快捷、稳定性 好、成本低廉等特点，适宜在基层医疗机构中推广应用^[18]。

成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

网址:http:// www.qctqct.cn 

手机 : 13072875151传真 :028-65830598

市场部电话 :028-65830598 028-67708638  

在线 QQ:110480527 联系人 : 王先生

邮箱:samwangcn@126.com

地址 : 成都市静康路536号