应重视肝纤维化血清学诊断的研究与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

肝纤维化、肝硬化是由多种原因引起肝脏慢性损 伤后，肝内细胞外间质（extracellular matrix，ECM)成 分异常沉积，进而导致肝功能受损的一个综合症。在 国人中，至少有10%的人有HBV感染，其中有相当部 分的人将按：急性肝炎—慢性肝炎—肝硬化的三步曲 发展。近来又发现丙型、丁型、戌型甚至庚型肝炎也会 遭致肝硬化。更令人不安的是，嗜酒风气猛增，酒精性 肝硬化在我国也应不在少数。对肝硬化的发病机制、 诊断及治疗的研究，正是目前肝病界探索的热点。临 床上很需要有一个方便、准确地反映肝纤维化发生、进 程的指标以指导诊断、治疗和判断预后。

判断慢性肝病的肝纤维化程度及其活动度，最可 靠的仍属肝活检标本的组织图象，即所谓的组织学活 动指数（HAI)。但是，肝活检有一定的危险性，不易为 患者所接受，亦难以重复性比较，而且不同类型肝硬化 存在着取材误差，故虽属“金指标”，但在实际应用中确 有相当大的局限性。

肝纤维化判断指标，最佳途径应是血清学指标，这 种无创性的检查目前已有不少报道，但较特异、敏感的 指标还是未找到。不管怎样，现在确有不少参考指标 已用于临床，并在诊断治疗中发挥作用。

肝纤维化形成是个极为复杂的病理生理过程，牵 涉到致病机体反应、反应细胞、细胞因子、细胞过量表 达产物、抑制因素以及降解酶等，任何单独从某一角度 强调其作用，都是片面的。因此，认识血清学的指标， 也是给综合分析作参考。

以下，将从血清学指标结合发病机制以及我们的 研究，概述一些指标的临床价值。

一、有关细胞因子与肝纤维化的研究

已研究并报告与肝纤维化有关的细胞因子已有 20余种，它们分别来自肝细胞、枯否细胞、肝窦内皮细 胞和星状细胞（Ito细胞）等。另外，在炎症时，大量肝 外单个核细胞的浸人，也是细胞因子的主要来源，这包 括淋巴细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血小板等。

参加的细胞因子虽很多，但直接涉及肝纤维化并 证实较有价值的有转化生长因子（TGF—卩1),它对星 状细胞的激活、增殖、表达ECM(细胞外间质）、TGF— P受体基因表达均有促进作用。IFN — Y对星状细胞 的增殖、胶原合成、分泌均有抑制作用。其他细胞因 子，如PDGFC血小板衍生生长因子）、IL一2、IL—4、IL 一 10、TNF—a等，皆有不同的作用，但不是主导的。

作者认为，测定血清TGF — 3l、IFN —7和TNF 一a对诊断肝纤维化的程度和预后有较大的价值。

二、细胞外间质(ECM)的研究和应用

早先认为，ECM是一种纤维化的结果，亦就是被 动沉积，但近来有关ECM及其受体，在信号传导和细 胞之间互相作用，已有许多新的发现，如透明质酸 (HA)和其受体（CD44)在肿瘤的转移机制中最为突 出。因此，对ECM的研究，已不只停留在肝纤维化 上，而是更多地注意其更深层次的作用。

ECM是个大家族，其分类也在不断进展，就目前 的资料可分以下几大类。

(一）胶原蛋白：人体各部分皆有胶原蛋白存在，目 前已发现19种，肝脏中存在I、IE、]V、VI、1、][、XI、 和XDI等8种。经我们研究，认为其中ni、]y和VI价值 最大。

1、瓜型前胶原氨基端肽（PIIINP，PIIIP)    血清

PIIIP是DI型前胶原在细胞外形成原胶原前，被相关

酶切下后进人血循的氨基端尾肽，故被视为肝纤维生 成的血清学指标。血清PIIIP增高，对肝病而言，提示 活动性肝纤维化，其临床价值已被公认。血循中的 PIIIP除由肾脏排泄外，也由肝窦内皮细胞经受体介 导而摄取，故急性肝炎、胶原纤维降解和肝功能损伤 时，血清PIIIP也增高。有人报道，在CC14诱导大鼠 肝纤维化过程中，肝内DI型前胶原mRNA明显下降， 但血清PIIIP仍持续处于高水平，这除反映仍存在活 动性肝纤维化外，部分原因可能与肝脏摄取和排泄能 力降低有关。此外，值得提出的是，在年幼儿童，生长 导致全身间质胶原的更新可使血清PIIIP水平明显增 高，故血清PIIIP检测对儿童肝纤维化没有判断价值。

2、 W型胶原 W型胶原是构成基底膜的主要成 份，肝纤维化时肝内IV型胶原合成增多并大量沉积，致 使肝窦毛细血管化。组织中的IV型胶原是以原胶原形 式交联组成三维网状结构而存在的，故其网状结构中 不仅含W型胶原的主三螺旋区，也含其氨基端的四聚 体（PIV — IVNP，7S胶原）和羧基端的二聚体（PW CP)。故检测血清7S胶原、PFCP或]V型胶原主三螺 旋区含量，是反映VI型胶原降解的指标。但降解的增 加常伴有更多的再合成，因此，确切地说，它们是反映 基底膜胶原更新率的指标。研究表明，慢性肝病患者 血清F型胶原主三螺旋区、7S胶原和PIVCP的增高 程度，与组织学上的肝纤维化程度相关。血清7S胶原 对判断肝硬化的敏感性（79%)和特异性（82%)，认为 它是反映活动性肝纤维化的最佳指标。7S胶原与P ID P联合检测，可提高判断的敏感性。

3、 V[型胶原 YI型胶原以原胶原的形式形成纤丝 而存在于组织中，过去认为肝内的含量甚微，晚近的研 究表明肝内亦广泛存在。肝纤维化时显著增加，尤以 纤维隔周围明显，并主要由贮脂细胞合成。VI型胶原 释放入血的机理尚不清楚，一般认为血清中的VI型胶 原含量明显升高，尤以慢活肝、肝硬化为显著，两者联 合的系列检测，对评估纤维生成与降解有较大帮助。

(二）非胶原蛋白

目前已发现非胶原蛋白有10余种，主要有：

1、层粘连蛋白P1片断（laminin Pl，Lam P1) 层粘连蛋白是基底膜成份中的主要糖蛋白，在肝内与 W型共同分布，大量沉积则引起肝窦毛细血管化，故其 血清值被认为是反映基底膜更新率的指标，可反映肝 窦的毛细血管化和汇管区纤维化。血清Lam P1对判 断肝纤维化的敏感性、特异性和正确率分别为63%、 98%和92%，说明其可作为肝纤维化的无创性指标， 但其敏感性不及PDIP和7S胶原。有报道肝病患者

血清Lam P1水平还与门静脉高压呈正相关，与食管 静脉曲张程度亦相关，提示其血清含量尚可反映慢性 肝病患者门静脉高压程度。

2、 纤维连接蛋白（fibronectin，FN)及其受体 (FNR) FN在体内有两种形式，即细胞型#血浆型。 血浆型FN绝大部分由肝细胞合成，FN与]Y型胶原、 Lam等共同组成基底膜成份。肝纤维化及肝硬化时， 肝组织中细胞型FN含量明显增加，但血浆FN水平 则明显降低，后者反映了肝细胞合成蛋白质功能的减 退。故血浆FN对肝纤维化的判断价值尚不能肯定。 最近有人用IUSA法研究了慢性肝病病人的FNR，发 现慢活肝、肝硬化、酒精性肝病和肝细胞癌病人血清 FNR水平显著升高，并与血清PD1P水平相关，认为 其是反映肝纤维化的一种有价值的指标。

3、 粗纤维调节素（undulimUN) UN是新近从 人胎盘和新生猴皮肤组织中分离到的一种细胞外基质 糖蛋白，与FN和细胞粘合素属同一超基因家族。正 常肝内UN主要沿肝窦周隙的单纤维及汇管区纤维 束分布，提示其与原纤维组成纤维束有关。它可作用 于I型胶原内链的酶切点，提示其有调节成熟胶原纤 维降解的作用。初步研究结果表明，血循环中的UN 系来自成熟结缔组织的降解。其血清含量是反映肝脏 结缔组织结构改建和降解的指标。有人测定血清中的 UN发现，活动性肝病病人UN增加可达正常值8倍 以上，以酒精肝性肝炎、原发性胆汁性肝硬化（3〜4 期）病人增高显著，但与P1DP、7S胶原和PWCP均不 相关。

(三）糖胺多糖CGAG)

已发现的GAG也有多种，其中HA最多，且已形 成临床常规指标。HA在肝硬化形成机制中的作用尚 不清楚，因其有协同胶原聚合、沉积和激活Ito细胞、 肝细胞的作用，推测肝间质内HA对促进肝纤维化有 直接作用。HA除肝脏合成外，其他许多体细胞皆可 合成，但其代谢主要是在肝内皮细胞。因此，血清中含 量升高可间接推测肝脏的功能。但分析其临床价值时 应全面考虑，这是因为：①血清HA与肝分泌能力及 肾排泄速率相关，并与门脉压力成相关；②血清HA 水平升高亦见于肺纤维化、硬皮病、晚期恶性肿瘤、类 风湿性关节炎等;③在急性肝炎及大量肝细胞坏死时 (药物、酒精、炎症等）HA水平可很高，但此时最多是 肝纤维化早期或者有肝纤维化形成的可能；④真正到 假小叶形成，肝脏已缩小时(肝纤维化晚期），HA水平 反而并不太高，甚至正常。从这里也可看出，某一项指 标，皆不能绝对化。

其他属于GAG的成分还有硫酸软骨素A和C (CSA、CSC)、硫酸角质素（KS)、肝素（HP)、硫酸乙酰 肝素（HS)等，皆有不少报告，但其确切价值还不详。

(四）蛋白多糖(PG)

PG由一个核心蛋白侧链连接多个数目不等的 GAG而构成，可存在于细胞表面、细胞内或与其他 ECM结合。近来不断有新的PG被发现，其命名根据 PG链上GAG的类型和组织来源而确定，例如基膜硫 酸肝素蛋白多糖（HS)，则是含硫酸肝素。现认为PG 分为①基质相关PG，包括aggrecan(CS/KS)、versican (CS/DC)、biglycan(CS/DC)、decorin(CS/DS)、fibro- modulin(CS/DS)、perlican( HS)、betaglycan( HS/CS) 和kimican等。它们的作用是组织的水合作用和结合 其他活性蛋白从而调节其生物活性，例如，通过核心蛋 白decorin与TGF—(31结合，调节胶原形成。②膜相 关PG，属跨膜蛋白一种，其中有Syndecan家族、glyci- pan 家族及 thrombomodulin、betaglycan 和 CD44(HA 受体），它们的作用是细胞间、细胞与基质间相互作用 的介质、生长因子受体和蛋白酶抑制剂等。

有关decorin研究报道较多。decorin由核心蛋白 和一条硫酸软骨素/皮肤软骨素组成，正常肝中含量很 低，随肝纤维化进展，含量稳定增加。decorin与多种 物质相结合，调节肝纤维化过程，如与TGF—卩1结合 来调节细胞增殖、分化，与I型胶原结合，抑制胶原的 合成，结合FN则介导细胞粘附。因此，decorin是一 种抗纤维化的间质成分。decorin与TGF —卩1结合研 究最多，因为TGF —卩1是促进细胞增殖、分化，而 decorin与其结合只是加强了其作用，还是抑制了纤维 化，这是大家所关心的。有人猜测是否结合后将TGF 一(3,活性基团隐蔽了，还是形成了复合物，被细胞内 吞，这都是值得探讨的问题。

三、肝纤维化形成的抑制物一一降解酶(金属蛋白 酶）

我们大量研究已证明，在肝脏急性损伤期ECM 合成大量增加，并无肝纤维化的形成。实际上，正常时 也有ECM形成，但不称作纤维化，这是因为纤维化的 “形成一降解”是一对矛盾，当这种矛盾失去平衡，如 ECM大量增加，降解相对减少或降解减低皆应是纤维 化的形成。因此，研究这种平衡似乎更重要。

ECM各成分的降解速度各不相同，PG代谢较迅 速，胶原类则较难。胶原的降解经历交联纤维的解聚、 三螺旋区的切割和变性胶原的解离等步骤，这需多种 酶参与，其中关键的，也是特异的是切割三螺旋区的组

织胶原酶。基质金属蛋白酶（MMPs)是最重要的胶原 降解酶。

(一）   MMPs的分类

目前应用分子克隆技术已知13种MMP，命名是 从MMP—1到MMP—13。其分类是：

1、 间质胶原酶类，包括间质胶原酶（MMP— 1)中 性粒细胞胶原酶（MMP — 8)和胶原酶_3(MMP — 13)，主要作用于I、m型胶原纤维。

2、 YI型胶原酶类。包括明胶酶A(72kD]Y型胶原 酶，MMP—2)和明胶酶一B(92kD]V型胶原酶，MMP 一9)，主要作用于DI、]y、V无形胶原和FN弹力纤维 等。

3、 基质溶解素类，包括基质溶解素MMP—3和 Matrilysin(MMP — 7)。作用于胶原 IE、]y、V、LN、 FN、PG 等。

(二）   MMPs的调控

调控是研究肝纤维化的重要内容，现已对MMPs 酶原的生成、激活及特异性抑制物有不少报道。

1、 MMPs 的生成调节：TNF — «、PDGF、bFGF、 EGF和IL一 1对MMPs的表达具有上调作用，而 TGF—(3l、IL—4则有下调作用。其他抑制MMPs基 因表达的因素包括皮质激素和维甲酸。此外，基质蛋 白降解产物以及它们合成的类似物通过与细胞膜受体 的相互作用亦刺激MMPs的表达，这是一个加速基质 降解的正反馈机制。

2、 酶原的激活：多数MMPs是以无活性的酶原形 式分泌的，只有被活化后才能降解基质蛋白。体内主 要活化系统可能是纤维蛋白的溶解酶原、胰蛋白酶、有

机汞等。

3、 酶活性的特异抑制物（TIMP): TIMP能与 MMPs非共价结合而抑制后者的活性，也可与酶原结 合，阻止其活化。目前，已发现至少三种TIMP。 EGF、b-FGF、TGF—(31、维甲酸等可刺激细胞TIMP _1的基因表达增加，而皮质醇起抑制作用。TGF — (31可抑制TIMP—1的表达。此外，《₂巨球蛋白可抑 制间质胶原酶和基质溶解素。

目前，TIMP — 1的水平已可用EIA法测定并用 于血清学的指标。有人对268例肝病患者进行检测， 发现TIMP—1水平较正常人明显升高，且于PIIIP、 1Y型胶原密切相关。TIMP异常升高可反映体内 ECM降解减少。也有人报告，TIMP — 1升高胶原酶 活性减少且两者呈负相关。因此，检查血清中的 TIMP-1和胶原酶的活性是一二种有价值的指标。

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