慢性乙肝肝组织病理、肝内IV型胶原免疫组化与血清肝纤维化 指标联合检测对肝纤维化诊断的相关研究与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

【摘要】目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)肝组织病理学、肝内IV型胶原(CIV)免疫组化与血清肝纤维化指 标联合检测对肝纤维化诊断的相关性。方法对104例CHB患者进行了肝组织病理学，肝内CIV免疫组化检 测及病理图像定量分析和血清肝纤维化指标(CIV、PCM及HA)的同步检测。结果慢性乙肝肝内C1V及血清 CIV、PCI和HA检测值均随肝病理损害及肝纤维化程度的加重而升高，经相关分析，其_r值分别为0.995、

1.1    985、0.980,/^>均<0.01。结论©肝内（：1¥与血清（：1¥、？(]1、1^检测可作为肝纤维化诊断的重要指标_；@

CHB患者肝窦内CIV的检出，为血清CIV的检测提供了病理学的证据；③CHB患者肝纤维化的程度，随肝损 害程度的加重而逐渐增强。

【关键词】乙型肝炎，慢性；肝脏/病理学；IV型胶原；免疫组化；肝纤维化

虽有报道，血清CIV检测对肝纤维化诊断具有一定的 价值^:1-³\但有关血清中CIV、PCII[和HA检测与肝脏病理 学分级(G)及纤维化分期(S)，与肝内CIV免疫组织化学 染色及病理图象定量分析，对肝纤维化诊断的意义及相关 性的报道较少。现对104例慢性乙肝患者进行肝组织病理

1材料与方法

1.1研究对象

104例CHB患者为感染科1994年至2002年间收治 的住院病人，男101例，女3例，年龄(33.2_±10.4)岁，病程 1~18年。正常对照组(8例)为外科手术无肝病患者的肝组

织。104例患者临床与病理学诊断及血清学分型符合2000 年西安肝病会议修订的病毒性肝炎诊断标准^:4!，依此标准， 病理组织学符合CHB轻度者74例，中度21例，重度9 例。

1.2肝活检组织取材及处理

患者人院后1周左右采用Merghini型针1 _s快速穿刺 法获得肝组织，10%甲醛固定，酒精逐级脱水，二甲苯透 明，常规石腊包埋切片，连续切片厚4 jun,分别作HE、 MASSON(三色改良法），网状纤维+MASSON染色（L丨LIE)。 肝活检同日采集病人静脉血5 ml,快速分离血清置-20^ 低温保吞待测相关指标。

1.3肝内CIV免疫组织化学染色及病理图像定置分析

肝内CIV免疫组织化学染色采用链菌素亲生物蛋白- 过氧化物酶法（简称S-P法），实验中第一抗体为美国 2丫1^0公司产品；0^)1\1£:(1¥971507¥?£_:丨0丨《^卩3)5- PKit试剂盒为美国ZYMED公司产品，中美合资福州迈新 公司分装。采用日本OLYMPUS-BX50-302E01型光学显微 镜，MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统由同济医 科大学提供，光镜下CIV呈淡黄色或棕褐色为阳性反应。 每例切片用10倍物镜彩色摄像输人微机，固定画面，自动 测量，连续测定20屏幕，取选择面积与实际面积百分比， 求得组织切片中CIV所占面积百分比。

1.4主要仪器与试剂来源

放免法检测血清中C丨V、PCI和HA。自动放免仪为上 海产FJ-2008型;CIV、HA试剂盒由上海海军医科所提供； PC m试剂盒由重庆肿瘤研究所提供。

1.5统计学方法

使用SPSS12.0软件包对所得结果进行统计分析，组间 用方差分析，直线相关分析和等级相关分析处理。

2结果

2.1慢性乙肝患者肝组织病理学诊断与肝内CIV免疫组 化检测间的相互关系

肝脏病理学诊断为慢性乙肝轻度组(Gl-2Sl-2)74例， 肝内CIV检测值为(6.1±².85)%_;中度组（G3S3)²1例,CIV 检测值为（1丨.32±2.99)%_;重度组（G4S4)9例，检测值为 (14.33±2.47)%;8例正常人肝组织（G0S0)肝内CIV检测 值为(5.63±2.23)%;轻、中、重度肝损害组各组间CIV检测 值比较差异有统计学意义(P<0.01 )。轻度肝损害组与正常 人组肝内CIV检测值比较差异有统计学意义(P<0.05)。 2.2肝内CIV与血清CIV、PCIII和HA检测值间的关系 肝脏病理学诊断为慢性乙肝轻、中、重度肝损害组，分 别为74例、21例和9例，正常人组8例。肝内CIV与血清 0¥^(：111和狀检测值，在轻度组分别为（6.1±2.85)%， (76.0±35.2)n.g/L, (132.5±32.3)M.g/L, (138.2±34.7)jtg/L； 中度组分别为（ll.³² ±².99)% , (163.7 ±⁷8.⁹)fig/L, (234.8 ±68.6)ji_g/L，（246_5±45.2)网几；重度组分别为 (14.33 ±2.47) %,(236.8 ± 114.9) jtg/L,(297.7 ±86.4) p-g/L, (306.4±79.6)jig/L; 8例正常人组检测值分别为（5.63±

2.23)% , (49.8±15.0)tj^L, (80.0 ±18.9)(Ag/L, (78.6 ±28.6) jtg/L。经统计，肝内CIV检测值和血清CIV、PCIII和HA检 测值在轻、中、重度肝损害各组间比较差异有统计学意义 (P<0.01);正常组肝内CIV和血清CIV、PCHI和HA检测 值与轻度肝损害组患者相应检测值比较差异有统计学意 义(p<o.〇5)。轻、中、重度肝损害组血清中av、pcin和ha 检测值分别与肝内CIV检测值比较，_r值分别为0.995、

1.  985、0.980，P均<0.01。表明血清 CIV、PC1 和 HA 检测值 与肝内CIV检测值间有显著的相关性，上述血清肝纤维化 标志物的检测，能反映慢性乙肝患者肝内纤维化的程度， 可作为临床肝纤维化诊断及指导治疗的重要指标。

2.3慢性乙肝患者肝内CIV免疫组化检测的病理形态学 特征

正常人肝内CIV免疫组化特点：在肝窦壁，可见微量 的CIV沉积，呈连续性线状阳性反应;在肝窦内，可见少量 散在的C1V阳性颗粒（图1)。而肝窦内的红细胞、淋巴细 胞、枯否氏细胞及血窦中的无定形物，均为无色的阴性反 应。

CHB轻度组（G1-2S1-2)患者肝内CIV免疫组化的主 要特点：在G1S1期，肝窦内可见淡黄或棕色“泥沙样"CIV 染色阳性颗粒,靠近肝窦壁侧沉积成厚薄不一的连续的线 状阳性反应。在汇管区与肝实质交界区，CIV阳性反应较 强。在轻度碎屑样坏死区，可见较弱的粗细不等的线状阳 性反应相互交织成网状。在扩大的纤维化汇管区，CIV阳 性反应显示增强，粗细不等的线状阳性纤维相互交织成 网，并向小叶内伸人。在G2S2期，除上述CIV阳性反应进 一步加强外，尚可见部分肝血窦因CIV等沉积而使肝窦发 生闭塞性改变。

在CHB中度组（G3S3)患者,CIV在肝实质内的分布 与轻度组基本相同，只是阳性反应相对更强。在扩大的纤 维化汇管区，CIV染色阳性反应较强，较粗的线状阳性纤 维，形成纤维隔伸人小叶内，分隔肝实质。在炎性坏死部 位,CIV大量沉积，相互交织成网状,其内浸入有数量不等 的炎性细胞。在增生的胆小管基底膜,其阳性反应亦较强。 中度肝损害组患者,50%的患者可见因CIV等沉积，而出 现散在的肝窦狭窄甚至完全闭塞的病理改变（图2)。

在CHB重度组(G4S4)患者，肝窦周CIV阳性反应显 著增强，呈连续线状棕褐色阳性反应，此期所有患者均可 见部分肝血窦因CIV等沉积,而使肝窦发生完全或不完全 性闭塞，并形成粗的棕褐色线条状。这些闭塞的肝窦，部分 可相互连接，形成大小不一形态不规则的环状改变，我们 称其为“CIV环”，这种“CIV环”的出现，可能是诊断早期 肝硬化的又一重要病理特征（图3)。

图丨~图3见封底。

3讨论

肝纤维化是多种原因如病毒感染、过度饮酒、自身免 疫性疾病、非酒精性脂肪肝等异常发展的慢性肝损伤的结 果^[5】。目前认为，肝纤维化是慢性肝损伤的愈合反应，但如

果这种反应持续存在，会导致肝硬化和肝衰竭^w。因此，肝 纤维化是多种原因所致慢性肝损伤的结果，也是慢性肝 病向肝硬化发展的必经途径。肝脏损伤后，纤维化的发 生是显著的^m。尽管有多种方法可诊断肝纤维化，但自从 Menghini推广采用经皮肝活检指导肝病诊断与治疗近五 十年来,至今仍认为肝组织病理学检查是诊断肝纤维化的 “金标准业已证明，各种原因所致的肝纤维化，最终 共同途径是肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞，合成 及分泌大量的细胞外间质，当其降解减少,便在肝内大量 沉积,逐步形成肝纤维化和肝硬化

肝内存在多种胶原蛋白，其中CIV为基底膜主要胶 原。CIV主要存在于肝窦周及胆管等周围。在肝纤维化的 早期CIV则增多，并在肝血窦周围沉积增加，对肝窦毛细 血管化的形成起着关键的作用；当肝窦内CIV过度沉积， 可致肝窦腔狭窄甚至完全闭塞，此时肝内微循环血流明显 受阻，肝细胞血供发生障碍，是肝纤维化发展为肝硬化形 成门脉高压症及肝功能障碍的主要病理学基础。这些肝内 CIV免疫组化特征性的改变，至今尚未见有报道，而既往 研究多为动物实验研究结果。在不同程度慢性乙肝患者及 正常人肝组织内C1V分布怎样，CIV与血清中CIV、PCIII 和HA以及与肝脏病理学分级及纤维化分期间有何相关 性，尚未见有报道。

本文通过对104例慢性乙肝患者的肝活检组织进行 了病理学轻、中、重分型的诊断，肝内炎症活动度分级及纤 维化分期的诊断，并进行了肝内CIV免疫组化检测与病理 图像定量分析和血清中CIV、PCffl及AH的同步检测研 究，结果表明，在肝损害轻、中、重度各组间，肝内CIV免疫 组化染色及病理图像定量分析值比较，差异均有统计学意 义(P<0.01)。同步血清中CIV、PCffl和AH检测值在各组 间比较差异均有统计学意义(/^O.Ol);血清中CIV、PCM 和AH检测值与肝内CIV检测值间分析表明存在显著的 相关性,r值分别为0.995 , 0.985 , 0.980,差异有统计学 意义(P<0.01)。表明慢性乙肝患者血清肝纤维化标志物的 检测，能够反映患者肝内纤维化的程度，是临床诊断肝纤 维化的良好指标。

同时，通过患者肝内CIV免疫组化病理形态学的观 察，使我们初步认识了 CHB患者肝纤维化发生、发展演变 的全过程，明确了由于肝内CIV等的沉积,可使肝血窦发 生不完全或完全性闭塞的病理改变,这些病理改变是造成 肝内微循环障碍，导致慢性乙肝向肝硬化发展，并形成门 脉高压症与肝功能衰竭等一系列病理生理学改变的基础。 通过对CHB患者血清CIV、PCffl和AH水平的检测以及 与肝内CIV同步检测表明，在临床不能开展肝病检测的情 况下，也能通过血清学无创性肝纤维化标志物C1V、PCM 和AH的检测，为临床提供了肝纤维化诊断及指导治疗的 可行性依据。

文中8例正常人肝组织为无肝病患者的手术病理标 本，通过肝内CIV免疫组化的检测，发现正常人肝内CIV

的特点为:肝窦周存在少量的CIV,且为连续性线状阳性 反应;在部分肝血窦内可见少量散在的CIV染色呈阳性的 颗粒，这些特征以往尚未见有报道。

综上所述:①正常人肝窦内存在少量CIV阳性颗粒， 肝窦周亦存在少许CIV,且为连续性线状阳性反应;②慢 性乙肝患者,肝窦周CIV为连续性线状阳性反应，其阳性 强度随肝损害轻、中、重程度的增强而逐渐增强；③慢性 乙肝患者，肝窦内可见大量“泥沙样”CIV阳性颗粒，其阳 性程度随肝损害程度的加重而增强，这些CIV阳性颗粒 的检出，为血清检测CIV提供了病理学的依据;④慢性乙 肝中度组患者，肝内CIV免疫组化检测可见少数肝血窦 因CIV等沉积，从而开始出现肝窦闭塞的病理改变;⑤慢 性乙肝重度组患者，可见大量肝血窦因CIV等沉积而发 生不完全或完全性闭塞，且这些闭塞的肝血窦可相互连 接，形成大小不等形状不规则的“CIV环”，这种“CIV环” 的检出，可能是诊断早期肝硬化的又一重要病理学特征， 并且可能是慢性肝病患者出现低蛋白血症及门脉高压症 等的病理学基础；⑥在汇管区及炎性坏死部位，CIV随肝 损程度的加重而加重；⑦血清CIV、PCM和HA的检测，为 慢性乙肝肝纤维化的诊断，提供了简易可行无创性的诊 断方法。

 成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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