肝纤维化新型分子诊断标志物与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

摘要：成都华西华科研究所研究肝纤维化是各种慢性肝病进展为肝硬化的重要病理阶段，及时准确的评估肝纤维化程度，对指导慢性肝病的治疗具有重 要意义。随着分子生物学技术的发展及分子诊断技术在临床的广泛应用，新型血清分子谂断标志物的检测将有助于肝纤维化的早 期诊断及精准治疗。近年研究发现并经临床验证有诊断价值的血清新型分子标志物包括成纤维细胞因子、基质金属蛋白酶及其抑 制物、细胞外基质相关标志物、非编码RNA等。此外，基因组学、蛋白质组学、代谢组学等分子组学检测亦有诊断意义。

关键词：肝硬化；生物学标记；诊断

肝纤维化是机体对各种病因引起的慢性肝损伤 的一种修复反应，是慢性肝病进展为肝硬化的重要病 理阶段^[1]。准确诊断肝纤维化病期、进展情况，选择 有效阻止肝纤维化的治疗策略、正确判断疗效是预防 终末期肝病发生的重要手段。肝纤维化的临床诊断 方法包括肝穿刺活组织检查、血清分子标志物、瞬时 弹性成像及影像学技术^[2]。肝穿刺活组织检查是肝 纤维化分期诊断的金标准，但存在有创性、样本误差 等局限性。瞬时弹性成像近年应用广泛，但肝脏炎 症、胆汁淤积等均有一定的影响。近年来血清分子生 物学标志物在肝纤维化诊断中的应用已成为研究的 热点。理想的肝纤维化分子标志物应具有肝脏特异 性高、能够反映细胞外基质（ECM)沉积和降解的动态 平衡，有助于肝纤维化早期诊断及监测其进程等特

点。此外，其检测技术精确、方法简便,具有良好的可 重复性。

常用的检测肝纤维化的血清标志物主要分为直 接和间接标志物两大类，应用较多的直接标志物为透 明质酸、I型和iv型胶原、层黏连蛋白、m型前胶原 等^[3];间接标志物包括血清alt、ast、凝血功能和血 小板计数等。上述标志物均与肝脏炎症活动、肝脏代 谢等状态有关，不能准确反映肝纤维化程度^[4]。随着 分子诊断技术逐步研发并应用于临床，新型血清分子 标志物不断涌现，主要包括成纤维细胞因子、基质金 属蛋白酶及其抑制物、ECM相关标志物、非编码 RNA、分子组学等。

1成纤维细胞因子

肝纤维化的发病机制复杂，受到多种细胞-细 胞、因子-因子相互制约，构成肝纤维化调节的一个 庞大网络体系。因此，肝纤维化形成和发展过程中， 关键细胞因子的活性及表达水平与肝纤维化的进展、 病变程度相关。近年来，随着肝纤维化机制研究的不

断深人，一些新型成纤维细胞因子逐渐受到关注。 TGF(3、结缔组织生长因子（connective tissue growth fac- tor，CTGF)为常用的肝纤维化相关因子。

1.1 结缔组织生长因子（CTGF) CTGF是由TGF(3 诱导产生的一种致纤维化蛋白，具有多种生物学活 性，其作为TGFp的下游反应元件主要参与调节细胞 增生、分化及ECM的形成。CTGF异常高表达在肝纤 维化病理过程中发挥重要作用，笔者的研究^[5]证实其 在非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠肝组织中表达显著 升髙。此外，一项纳人64例慢性丙型肝炎、22例丙型 肝炎肝硬化患者的研究~发现，血清CTGF水平随肝 纤维化病理学分级进展而递增，提示血清CTGF水平 可反映肝纤维化进程。

1.2白细胞介素（IL) IL参与肝星状细胞增殖、集 落因子的趋化等多个肝纤维化发生发展环节。已有 研究^[7]证实，IL - 1、IL -6、IL - 8具有促肝纤维化作 用，IL -〗0具有抗肝纤维化作用。近年来，一些新的 IL家族分子在肝纤维化中的作用被广泛关注。日本 Shoji等^[81研究报道197例经肝穿刺活组织检查证实 为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)患者的血清IL - 34 水平随肝纤维化加重而逐渐增高,并进一步建立IL - 34 积分模型[IL -34 - FS = (0• 038 7 x IL -34(pg/ml) + 0.362 3 xlV 胶原 7S(ng/ml) +0.018 4 x 年龄（岁）- 1.185 0)],经对比分析证实该模型诊断肝纤维化分级 显著优于其他模型，诊断F4期肝纤维化的特异度及 敏感度均达80%以上，并可作为肝纤维化的独立预测 指标。

1.3趋化因子趋化因子在肝纤维化进展中发挥重 要作用，其可能通过介导粒细胞、淋巴细胞聚集参与 炎性反应，调节肝纤维化的进展。两项独立队列研 究^[9]纳人180例HCV感染者，观察肝组织及血清CXCL9 和CXCL10表达水平，结果显示患者肝组织和血清 CXCL9、CXCL10表达水平均显著上调,且与肝纤维化 分期呈正相关。Berres等^[1°^]报道，慢性HCV感染者血 清CXCL10、CXCL11水平随肝纤维化程度加重而逐渐 升高。另有研究^[n1发现,HBV和HCV相关重度肝纤 维化患者血清CXCL12水平显著增加，CXCL12对重度 肝纤维化的诊断优于轻度肝纤维化。上述研究表明， CXCL9 ~ 12可作为肝纤维化进展的分子标志物。

1.4 高尔基体蛋白 73 ( Golgi protein 73 , GP73 ) GP73是一种新型高尔基蛋白。Wei等^n2]在北京地坛

医院及解放军三〇二医院进行了 2项对照研究，其中 761例HBV感染者行弹性成像检测，633例HBV感染 者行肝穿刺活组织检查，对比分析患者血清GP73水 平与肝纤维化程度的相关性。研究结果显示血清 GP73水平与肝脏硬度呈正相关（_r =0. 601)，诊断显 著肝纤维化（為F2)的敏感度和特异度分别为 61 81 %和80. 05% (临界值为⁷6.6 ng/ml);与肝穿刺 病理对比研究显示，血清GP73水平与肝纤维化分期 显著相关，血清GP73浓度85 ng/ml可作为显著肝纤 维化的临界值。此外，有研究^[13]通过分析148例 HBV感染者（轻度纤维化80例，显著纤维化68例）血 清GP73水平与肝组织学变化的关系，并与其他肝纤 维化模型对比分析，亦证实显著纤维化患者血清 GP73水平与肝纤维化程度有较好的相关性,其敏感 度为6入6%，特异度为⁸〇%，优于FibroTest、ALT与 PLT比值指数（APRI)等评分;多因素logistic回归分 析显示构建GP73、nb_r〇Test、APRI联合预测模型诊断 率显著提高。

1.5 血清细胞角蛋白片段（CK18-M30) CK18 - M30是反映肝细胞凋亡的一种分子标志物。一项纳 入856例NAFLD患者的研究[^14]结果显示，血清CK - 18能够反映NAFLD患者脂肪变及肝纤维化程度，其 敏感度和特异度分别为78%和87%。另一项纳人 3064例NAFLD患者的Meta分析[^15]证实，血清CK - 18水平诊断对非酒精性脂肪性肝炎相关F3 ~ F4期肝 纤维化具有较高的准确度[受试者工作特征曲线下面 积（AUC)为0.85],提示CK-18可作为肝纤维化的 血清诊断分子标志物。

2基质金属蛋白酶（MMP)及其抑制物

研究^[16]发现，肝细胞膜分泌的MMP和金属蛋白 酶组织抑制因子（TIMP)是ECM代谢过程中的关键 酶，在肝纤维化形成和降解的动态平衡中发挥重要作 用，可用于评估肝纤维化程度。血清TIMP-1预测早 期肝硬化的敏感度达1〇〇%，特异度为56% ~ 75%^[17]。但近年来研究发现，MMP/TIMP比值能更 准确反映肝纤维化程度。Lichtinghagen等通过对 比分析40例HCV感染者、20例HCV相关肝硬化患 者及20例健康对照者血清MMP/TIMP比值，发现 MMP -2/TIMP - 1比值与肝组织炎症及纤维化分级 显著相关。25例儿童胆道闭锁分析显示，血清MMP -⁷ 水平与肝组织MMP -7表达呈一致性上调^[19]，提示

MMP -7可作为诊断胆道闭锁所致肝纤维化的生物学 标志物。

3 ECM相关标志物

肝纤维化的本质为以胶原为主的ECM合成增 多、降解减少，致使过多ECM沉积形成肝纤维化。 ECM合成与降解相关细胞因子的表达及分泌可标志 ECM沉积和肝纤维化的程度。

3. 1 微纤维相关蛋白 4(microfibrillar associated glyco­protein 4, MFAP-4) MFAP-4由肌成纤维细胞合 成，作为细胞整合素配体参与细胞黏附和细胞间的相 互作用，在ECM代谢过程中发挥重要作用。李森林 等^[2°^]分析了 20例HBV相关肝纤维化患者血清 MFAP -4水平及肝组织病理学变化，发现MFAP - 4 水平与肝脏炎症活动度及纤维化程度呈正相关，提示 血清MFAP -4可鉴别早期肝纤维化、进展期肝纤维 化及肝硬化。为明确MFAP -4的肝脏特异性， Mttlleken等^[21]观察了 91例肺纤维化患者血清MFAP -4 变化，证实肺纤维化患者血清MFAP -4与健康对照 组无明显差异，提示MFAP -4具有肝脏特异性，有望 成为肝纤维化的血清学标志物。

3.2人软骨糖蛋白（YKL_⁴〇) YKL-⁴〇属于甲壳 质酶家族,是一种ECM相关蛋白，与ECM的重构和 降解密切相关。研究^[22]报道，酒精性肝纤维化及丙 型肝炎肝纤维化患者血清YKL -40水平显著升高。 Rath等^[23]对比分析55例慢性丙型肝炎患者血清 YKL -40和瞬时弹性成像的诊断效果，结果显示YKL - 40诊断F>2、F為3及F =4肝纤维化的AUC分别为 0• 791、0.914及0• 936，血清YKL - 40诊断显著肝纤 维化（F>3)的准确性明显髙于瞬时弹性成像，表明血 清YKL-40具有良好的临床诊断价值。Johansen 等^[24]观察129例酒精性肝病患者血清YKL -40水 平，证实YKL -40水平随肝纤维化程度加重呈递增趋 势，轻、中、重度肝纤维化均值依次为270、466、676 (xg/L,敏感度、特异度分别为51%和88%,提示 YKL -40为鉴别肝纤维化分期具有良好特异性的血 清分子标志物。

3. 3 被基化触珠蛋白（fucosylated haptoglobin, Fuc - Hpt)和 Mac - 2 结合蛋白（Mac - 2 binding protein， Mac -2 bp) Fuc - Hpt 和 Mac - 2 bp 曾作为肿瘤标 志物。近年研究发现二者与非酒精性脂肪性肝纤维 化显著相关。一项对126例经肝穿刺证实NAFLD患

者的研究^[25]显示，血清Fuc - Hpt水平与肝组织NAS 评分、肝纤维化分级显著相关。Tawara等^[26]分析了 317例慢性丙型肝炎患者血清Fuc - H_Pt、Mac -2 bp 水平与肝纤维化的关系，结果显示Fuc - H_Pt、Mac - 2 bp随肝纤维化进展而呈递增趋势，多变量分析证 实，Mac-2 bp与Fuc - Hpt可分别作为中度（F英²) 及重度（F &3)肝纤维化的独立预测因子及诊断标志 物，联合应用Mac -2 bp、Fuc - Hpt及FIB -4、可显著 提高诊断准确度。

4 非编码 RNA(ncRNA)

ncRNA是一类功能性RNA分子,其不编码蛋白 质，但能通过不同机制调控编码蛋白基因的表达和功 能,参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢等重要的生物学 过程，并且与疾病的发生发展、诊断和治疗有着密切 联系。目前，关于ncRNA的相关研究主要针对mi- croRNA(miRNA)和长链非编码 RNA(lncRNA)。

4.1 microRNA(miRNA) miRNA 在正常机体循环 中种类和丰度处于相对稳定的状态，而肝脏代谢异常 可破坏机体循环miRNA稳态，表现为疾病状态下 miRNA的差异表达。循环miRNA具有良好的稳定性 和表达的特异性,现已成为疾病诊断和预后判断的新 型分子标志物。El - Ahwany等^[27]检测68例早期及 65例显著丙型肝炎肝纤维化患者血清miRNA表达水 平，其中miR - 138水平明显增高，诊断早期肝纤维化 的敏感度为89. 3% ,特异度为71.43%，诊断显著肝 纤维化的敏感度为89. 3%，特异度为93. 2% ; _miR - 143诊断显著肝纤维化的敏感度及特异度分别为 75%及88. 4%,表明miR-138可作为早期及显著肝 纤维化的诊断标志物，而miR - 143可作为显著肝纤 维化的诊断标志物。Chen等^[28]发现扶正化瘀治疗的 HBV患者血清内存在112个差异表达miRNA，进一步 通过miRNA - Target Network评估扶正化疲治疗HBV 疗效，建立P = miRNAs诊断模型，发现miRNA诊断模 型特异度及敏感度均高于Child - Pugh分级。

Cermelli等^[29]对NAFLD患者及正常人的血清 miRNA表达谱进行对比分析，患者血清miR -34a和 miR - 122表达水平明显上调，且与ALT及AST水平、 炎症分级、肝纤维化分期呈正相关，提示miR -34a和 miR - 122可作为非酒精性脂肪性肝纤维化的诊断标 志物。11_〇心&₁1巧等^[3°^]对比分析肝硬化患者（6⁷例） 及健康人群（17例）血清miR - 29a水平，结果显示

临床肝胆病杂志第33卷第3期2017年3月J Clin Hepatol, Vol. 33 No. 3, Mar. 2017

miR -29a血清水平随Child - Pugh分级加重而逐渐 降低，而与MELD评分呈相反趋势。Ninomiya等^[31] 对比分析原发性胆汁性肝硬化（PBC) (10例）、慢性 乙型肝炎(5例）、慢性丙型肝炎（5例）及健康志愿者 (5例）血清miRNA表达谱变化，结果表明PBC患者 血清中 hsa - miR - 503 - 3p、197 - 3p、500a - 3p 水平 显著低于健康对照组，hsa -miR -505 -3p、139 -⁵p和 197 -3_P水平显著低于病毒性肝炎肝纤维化患者。上 述研究表明，血清miRNA可作为诊断不同病因肝纤维 化的指标，并可能作为抗肝纤维化治疗效果的潜在评 估指标。

4.2 长链非编码RNA(lncRNA) IncRNA是指长度 超过200 b_P的ncRNA，越来越多的研究显示肝纤维化 进展过程中多种IncRNA表达发生改变。张蕾等^[32] 比较PBC患者和健康人群外周血单个核细胞中 IncRNA - AK053349 表达，结果显示 PBC 患者 IncRNA - AK053349较健康对照组明显增高，并与肝组织学分期、 Mayo风险评分密切相关，表明lncRNA - AK053349可 能为判断PBC肝纤维化及肝损伤程度的潜在标志物。

本课题组采用高通量测序对比丙型肝炎肝纤维 化患者与健康人群血浆lncRNA差异表达谱，发现474 个表达上调、293个表达下调;进一步观察轻度肝纤维 化（F<2)、显著肝纤维化（2矣F <4)、健康对照组血 浆中lncRNA - ATB表达变化，结果显示lncRNA - ATB水平与肝纤维化分期显著相关[_r = 0. 785，AUC 为〇. 877]，敏感度、特异度分别为78. 7%和88%，该 指标有望作为肝纤维化的分子诊断标志物^[33]。

ncRNA的研究已经取得很大进展,并发现了在肝 纤维化中发挥重要作用的ncRNA,为肝纤维化的早期 无创性诊断、鉴别、发病机制的研究及治疗提供了新 的思路。然而，对于外周循环中ncRNA分泌机制、动 力学特点及清除机制目前尚未完全明确，因此其准确 性及特异性有待进一步研究。

5分子组学

近十年来，组学在生物医学研究领域中发挥着越 来越重要的作用。基因组学、蛋白质组学以及近年迅 速发展起来的糖组学均可反映肝脏组织的整体性变 化，通过分析比较，可得到肝纤维化阶段差异表达的 基因、蛋白质及糖类，进一步研究其功能作用，寻找特 异性强的反映肝纤维化程度的血清学指标。

5.1基因组学基因组学已从基因序列研究转移到

基因功能研究，即为功能基因组学。单核苷酸多态性 (single - nucleotide polymorphism，SNP)可在多方面影 响肝纤维化的发生及发展。加利福尼亚大学一项多 中心队列研究^[34]纳人916例慢性丙型肝炎患者进行 SNP研究，结果发现1609个SNP位点与进展期肝纤 维化相关，其中DEAD盒多肽5、肉毒碱棕榈酰基转移 酶1A与严重肝纤维化密切相关。肝纤维化相关因子 的基因多态性可能影响肝纤维化的发生，多个SNP标 志物联合可预测慢性丙型肝炎肝硬化发生与进展的 风险。

5.2蛋白质组学蛋白质组学在于大规模水平研究 蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰 及蛋白间相互作用。Xu等^[35]通过对126例慢性乙型 肝炎患者血清二维凝胶电泳检测发现转铁蛋白等3 个小分子蛋白，其诊断中度肝纤维化（>S2)的AUC 为0. 884〜0. 9%，诊断显著肝纤维化S3)的AUC 为 0. 785 ~ 0• 875。Bell 等^M 采用 LC/MS - MS 质谱 法对比分析69例NAFLD患者和16例肥胖对照者血 清蛋白，发现72个差异显著的蛋白，其中27个蛋白 任意2组差异>30% , 15个蛋白的差异表达与F3/F4 期肝纤维化程度相关。

5.3糖组学肝纤维化形成与ECM合成密切相关， ECM主要为胶原、糖蛋白和蛋白多糖，Callewaert 等^[37]应用糖组学技术诊断代偿和失代偿期肝硬化， 应用基于DNA序列分析的临床糖组学技术,检测患 者血清蛋白N -糖苷，可初步诊断肝纤维化，在代偿 性肝硬化患者中，其诊断敏感度和特异度分别为79% 和86%，而在失代偿期肝硬化患者中敏感度和特异度 均为100%，表明通过检测患者血清糖组学的差异变 化，可区分不同程度肝纤维化。

5.4代谢组学代谢组学是继基因组学、蛋白组学 及糖组学之后的生物学新平台，能够定性和定量评估 生物体受到异常刺激后代谢产物的动态变化。肝脏 是人体最重要的代谢器官，糖类、脂类及氨基酸3大 营养物质的代谢过程均在肝脏完成，因此，从代谢组 学可对肝损伤程度、病变性质进行系统研究。日本学 者 Tokushige 等[^38]对 NFALD 和 PBC 患者进行 LC/MS - MS质谱分析发现包括脱氢异雄酮、还原尿睾酮在内 的28种代谢产物与肝纤维化相关。Embade等^[39]应 用核磁共振氢谱（^ - NMR)技术检测丙型肝炎肝纤 维化，发现胆碱、乙酰乙酸盐、低密度脂蛋白为丙型肝炎肝纤维化患者差异最显著的代谢物，提示¹H - NMR 技术可作为鉴别肝纤维化存在与否、严重程度的诊断

方法。

组学可以在尚未出现肝纤维化之前区别出差异 表达的基因、蛋白记忆不同的代谢水平，从而达到早 期预测的目的。此外，组学可通过鉴定疾病进展中的 基因/蛋白表达谱，预测疾病的转归及疗效。

6血清生物学指标的特点及存在的问题

血清新型分子标志物具有无创性、费用较低、利 于动态监测等优点，对肝纤维化的诊断具有重要价 值。目前，肝纤维化血清分子诊断标志物的应用尚缺 乏统一标准，单一指标存在误差，有时需多指标联合 诊断，以提高血清学标志物的临床价值。

7展望

肝纤维化是一个复杂的病理过程，其诊断需根据 病原学、临床、影像学、肝组织病理学及生化学等多方 面联合评估，新型血清分子诊断标志物的临床应用将 有助于肝纤维化病因分析、纤维化程度鉴别及预后判 断，为临床治疗策略的制订及疗效判断提供科学 依据。

成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

网址:http:// www.qctqct.cn 

手机 : 13072875151传真 :028-65830598

市场部电话 :028-65830598 028-67708638 

在线 QQ:110480527 联系人 : 王先生

邮箱:samwangcn@126.com

地址 : 成都市静康路536号