硫氧还蛋白-2在制备肝纤维化诊断制剂中的用途与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及硫氧还蛋白-2在制药中的新用途，具体涉及硫 氧还蛋白-2在制备肝纤维化诊断制剂中的用途 背景技术

据有关统计，全世界约有3.5亿乙肝病毒携带者，我国的乙型肝炎病毒慢性 携带者约有1.25亿，每年至少有一百万患者死于乙肝病毒感染导致的慢性肝病， 包括肝硬化和肝癌，目前尚缺乏有效的治疗手段。

有研究认为，肝纤维化是慢性乙肝病毒感染的中间过程，是肝脏对慢性肝损 伤的一系列修复反应，如不加以治疗，将有可能发展为肝硬化甚至肝癌。研究表 明在肝纤维化过程中，肝脏各类实质和非实质细胞发生明显的结构和功能变化， 激活星状细胞合成大量的细胞外基质蛋白（ECM)并导致肝脏纤维化。

肝纤维化的诊断对于病情的判断及指导临床治疗均有重要的指导意义。目 前，临床所采用的诊断方法主要包括三大类，即病理学、影像学及血清学诊断。

肝穿活检是诊断肝纤维化的金标准。通过对病人肝脏组织的染色将肝纤维化 的程度分为S1-S4四期；将炎症活动程度分为G1-G4四级。据有关统计显示， 肝穿活检具有损伤性，会引起约40%病人不适，引起0.5%病人发生并发症。取 得的组织量较少时诊断误差较大，主观判断性较强，难以用于临床的动态观察和 预后判断。因此，发展可靠、简单、非创伤性检验方法诊断肝纤维化显得尤为需 要。

影像学检查是诊断肝纤维化的非创伤性手段之一。其中超声检查因其经济、 方便、无创，成为临床上最常用的检查手段。超声诊断肝硬变，特别是失代偿期 肝硬变的临床价值已得到基本肯定。彩色多普勒超声的应用为无创性评价血流动 力学提供了新的手段。但是在肝纤维化早期，肝脏的形态学和血流动力学改变不 明显，超声对早期肝纤维化的诊断意义存在有局限性。

实验室血液学检查是最具应用前景的非创伤性检测手段。主要的指标分为以 下五类。①反映ECM成份合成增多的指标，如III型前胶原（procollagen III，

PC III)、III 型前胶原氨基端肽（type III procollagen aminopeptide，PIIIP)、IV 型 胶原（collagenIV，CIV)、层粘蛋白（laminin，LN)、透明质酸（hyaluronicacid， HA)及纤维连接蛋白（fibronectin，FN)等；②反映ECM合成酶改变的指标， 如单胺氧化酶（monoamineoxidase，MAO)及脯氣酰轻化酶（prolyhydroxylase， PH);③反映ECM降解的指标，如脯氣酸肽酶(prolidase，PLD)、脯氨酸(praline， Pro)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases， MMPs)及其组织抑制因子 (tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)等；④参与肝纤维化过程的细胞 因子，如转化生长因子0 1 (TGF-P1)、肿瘤坏死因子a (TNF-a)、白细胞介 素-6<IL-6)等；⑤其他血液学指标，如PGA指数、AST/ALT等。目前,这些血 液学标志物，对于检测早期肝纤维化的敏感度都不高；并且尚未发现单个的标志 物可以有效地用于肝纤维化病程的监控。

在血液学指标中，以第一类反映ECM成份合成增多的指标研究最多、最深 入，实验室技术也较成熟，临床应用最广。但这些标志物仅能大体反映肝纤维化 程度，对纤维化分期无直接指导意义。它们受肝纤维化外多种因素影响，尤其受 慢性肝炎活动度的影响。临床流行病学研究了这些标志物对肝纤维化分期的意义 以及与慢性肝炎活动度的关系，发现各项纤维化指标的增高与纤维化的严重程度 相关，但相关系数都不高；同时，随着炎症程度的加重，各项纤维化指标也有明 显升高。

迄今，尚没有一个非创伤性指标可以准确地诊断肝纤维化。因此联合多个血 液学指标，共同评价肝纤维化程度以提高临床诊断的准确率成为肝纤维化非创伤 性诊断的研究热点。但多数的联合非创伤性研究大多是根据研究者的经验或者是 文献报道事先确定联合的指标，然后计算联合指标诊断的灵敏度和特异度，这样 确定的指标不够全面。与此同时，在多数的研究中所研究的指标仍不能将四期肝 纤维化区分开来。

蛋白质组学是一门新兴的学科，被广泛应用于研究疾病的诊断、治疗和预防。 蛋白质组学在肝脏疾病研究中的一个重要应用是通过比较分析正常组织细胞与 异常组织细胞、肝脏疾病在不同发展时期细胞内整体蛋白质的表达差异，对表达 有差异的蛋白进行鉴定和定量，寻找与肝脏疾病相关的新的标志物，为肝脏疾病 研究提供新的手段和依据。Ying Liu等运用2DE技术研究了 CC1₄损伤的大鼠肝

脏蛋白表达的差异，发现有30多种蛋白表达发生改变。Kristensen等研究了大鼠 HSC体内及体外激活前后的蛋白质组学，共鉴定了 43种表达水平发生改变的蛋 白质。

目前，2DE结合质谱分析仍是蛋白质组学研究最流行和较可靠的技术平台。 但是2DE操作复杂、工作量大，胶和胶之间的变异会导致对蛋白表达水平差异 的错误判断。在2DE的基础上，发展和完善了 DIGE技术。该技术结合了多重 荧光分析的方法，将待比较的蛋白质样品经不同的荧光染料（Cy2、Cy3、Cy5) 标记后，在同一块胶上共同分离3个分别由不同荧光标记的样品，省去了不同胶 图之间的匹配问题。并且引入了内标的概念，降低了胶和胶之间的变异，极大地 提高了结果的准确性、可靠性和重复性。由于荧光染料有较好的灵敏度和动态范 围，DIGE技术能比传统的蛋白染色方法提供更精确的定性和定量分析。该技术 己应用于人结肠癌、前列腺癌、胰腺癌等的蛋白质组学研究之中。

发明内容

本发明的目的是提供硫氧还蛋白-2 (PrxII)的新的用途，具体涉及硫氧还蛋 白-2在制备肝纤维化诊断制剂中的用途。

PrxII由198个氨基酸组成，具有如下氨基酸序列_：（下划线序列为质谱鉴定 匹配序列）

所述PrxII分子量约为21. 8KDa,是一类新发现的超氧化物酶，可以有效地 降低细胞内过氧化氢水平，抵御过氧化引起的细胞损伤。PrxII还可能通过调控 TNF-a信号通路和PDGF信号通路发挥抗氧化作用，或者通过诱导肝实质细胞 和肝星状细胞的分化和侵袭、提高细胞对过氧化氢的耐受等机制发挥抗氧化作 用。

但迄今为止，尚未见有关硫氧还蛋白-2与肝纤维化分期之间的关系的报道。

本发明采用DIGE技术对不同病程肝纤维化病人以及正常志愿者和肝硬化 病人血浆蛋白质组的差异进行了实验研究，结果显示，血浆中硫氧还蛋白-2 (简称

PrxII)的表达变化与肝纤维化病程相关，结果表明，所述的PrxII可作为肝纤维 化病程相关的疾病标志物，进一步制备肝纤维化诊断制剂。

本发明通过与肝纤维化相关的其它21项血液生化指标的比较和联用，构建 了构建肝纤维化无创诊断的决策树，并进行了临床样本的验证。

本发明通过下述技术方案实现：

1、 确定肝纤维化病程相关血浆差异蛋白硫氧还蛋白-2

1.1血浆样本和血清样本的收集；

1.2样品中高丰度蛋白的去除、样品的浓缩和纯化、样品中蛋白定量；

1.  样品的 2D-DIGE 实验，参考 Amersham 公司的 Ettan DIGE User Manual(l 8-1164-40)方法；

2.  2D-DIGE图像采集与分析；

1.5差异蛋白点的质谱鉴定，肽序列采用Mascot搜索引擎搜索NCBInr数据 库或Swissprot数据库；

1.6差异蛋白的验证，运用Westemblot法对差异蛋白进行免疫杂交验证。

2、 构建肝纤维化无创诊断决策树

2.1检测血液学指标：采用直接ELISA法测定血浆中PrxII、凝集素CLU、 结合珠蛋白HP，载脂蛋白ApoAl的含量;按常规检测或由全自动生化仪完成血 清肝纤维化四项指标HA、PIIIP、LN和C-IV以及其余17项血液生化指标测定,

表1是17项血液生化指标。

2.2统计分析，构建决策树；

2、3构建肝纤维化无创诊断决策树：从上述4个血浆差异蛋白、4项血清纤 维化指标和17项临床血液学指标中，筛选出凝血酶原时间(PT)、血清前白蛋白 (Pre)、透明质酸(HA)和硫氧还蛋白2(PrxI)4个指标,构建肝纤维化无创诊断的决 策树，从而区分不同分期的肝纤维化。

上述四个血液学指标的生理意义分别为：

凝血酶原时间（PT)不仅反映血浆中凝血酶原水平，也反映凝血因子V、 W、X以及纤维蛋白原在血浆中的水平。肝脏是合成凝血因子的主要器官，凝 血酶原是在肝脏合成的一种糖蛋白，因而，在肝纤维化时，肝实质细胞受损严重 而广泛坏死时，维生素K摄取利用障碍，肝脏合成依赖维生素K的凝血因子(II、

VD、IX、X)的量减少，引起这些因子的血浆水平减低，从而导致凝血酶原时间 延长。

血清前白蛋白(Pre)变化机制与白蛋白相似，主要由肝细胞合成，肝细胞受 损害时，其合成减少，血中的浓度也相应的降低。由于白蛋白的半衰期长(2〜3 周)，而且容易受外源性白蛋白的影响，故不能及时地反映肝细胞的合成蛋白能 力，而血清前白蛋白的半衰期只有1. 9d，故能敏感地反映肝脏的合成功能。

透明质酸(HA)是肝细胞外间质中蛋白多糖，主要由肝内间质细胞合成，内 皮细胞参与降解。血清透明质酸的浓度是肝脏合成和降解平衡的结果。肝纤维化 时透明质酸合成增加，降解减少，血清水平升高。

硫氧还蛋白2 (PrxII)，是一类新发现的超氧化物酶，可以有效地降低细胞 内过氧化氢水平，抵御过氧化引起的细胞损伤。PrxII还可能通过调控TNF-a信 号通路和PDGF信号通路发挥抗氧化作用，或者通过诱导肝实质细胞和肝星状细 胞的分化和侵袭、提高细胞对过氧化氢的耐受等机制发挥抗氧化作用。

表1

检测指标		英文全称		中文全称
A		albumin		白蛋白
A/G		albumin/IgG		白/球比
AFP		alpha fetal protein		甲胎蛋白
AKP		alkaline phosphotase		碱性磷酸酶
AST/ALT		aspartate / alkaline aminotransferase		谷草转氨酶/谷丙转氨酶
CB		Combined bilirubin		结合胆红素
CHE		cholinesterase		胆碱酯酶
G		IgG		免疫球蛋白
HB		hemoglobin		血红蛋白
PLT		platelets		血小板
Pre		prealbumin		前白蛋白
PT		Prothrombin time		凝血酶原时间
yGT		Gama glutamyl transpeptidase		Y谷氨酰转肽酶
TB	total bilirubin		总胆红素
TC	total cholesterol		总胆固醇
TG	triglyceride		甘油三酯
WBC	white blood cells		白细胞

本发明运用改良的荧光标记的双向电泳技术，研究了不同病程的肝纤维化病 人血浆蛋白质组的差异，确定并验证了硫氧还蛋白2的表达随着病程的发展而上 升，可进一步制备肝纤维化诊断制剂，用于诊断不同阶段的肝纤维化病人。本发 明在此基础上，从所述的25个血液学指标中筛选出4个指标，构建了可以高效 地诊断肝纤维化各个阶段的决策树。

本发明能够联合多个血液学指标，共同评价肝纤维化程度，可全面准确地提 高临床非创伤性诊断肝纤维化的准确率，灵敏度和特异度。

附图说明

图1是硫氧还蛋白2在2D-DIGE实验中的表达趋势，

其中显示，随着肝纤维化病程的加重，硫氧还蛋白2的表达量上升。

图2是硫氧还蛋白2的质谱鉴定PMF和MS/MS图谱，

其中，图2A是酶解蛋白的PMF图，图2B、C、D是肽段1211Da、1735Da和

1864Da 的 MS/MS 图。

图3是硫氧还蛋白2的免疫验证结果。

图4是用于肝纤维化无创诊断的决策树。

具体实施方式 实施掏1

1、确定肝纤维化病程相关血浆差异蛋白硫氧还蛋白-2

1.1收集血浆样本和血清样本的：抽取病人或正常人的空腹静脉血5ml，放 入肝素抗凝管中，迅速混匀后，3000g离心lOmin，收集上层血衆，分装后-80 °C备用。抽取病人或正常人的空腹静脉血5ml，室温放置1小时，3000g离心 lOmin,收集上层血清，分装后-80°C备用。

表2是用于差异蛋白筛选和验证的临床样本资料表。

表2

筛选实验

验证实验

轻度

显著

轻度

显著

健康

肝硬化

健康

肝硬化

纤维化

纤维化

纤维化

纤维化

样本数

7

5

10

7

42

24

32

12

年龄

35.7

40_5 士

35.1土

37.6土

33.0土

36.4 土

35.4士

38.8土

Mean 士 SD

±4.1

10.5

9.8

14.5

9.0

10.3

12.5

13.1

性别（男/女）

7/0

5/0

10/0

7/0

40/2

21/3

29/3

li/i

1.2样品中高丰度蛋白的去除、样品的浓缩和纯化、样品中蛋白定量：采用 Merck公司的试剂盒，按公司说明书操作。

3.  样品的 2D-DIGE 实验：参考 Amersham 公司的 Ettan DIGE User Manual(l 8-1164-40)方法。

4.  2D-DIGE图像采集与分析：凝胶用Typhoon9410激光扫描仪扫描。激发 波长分别为：Cy2，488nm; Cy3，532nm; Cy5，633nm。图像用 ImageQuant5.2 或DeDyd_er6.5软件自动识别蛋白质点，并且手工确认。所有的胶上的点都均一 化后进行匹配。蛋白点表达量的变化用one-way ANOVA进行分析，并进行组间 两两t检验。显著性差异的阈值设为p<0.05, Ratio>1.5。

1.5差异蛋白点的质谱鉴定：手动操作Ettan Spot Picker自动切胶仪(Version 1.0)切取凝胶中的点并转移至96孔板中，按质谱兼容银染法相应的胶内酶解方案 酶解蛋白。采用4700 Proteomics Ananlyzer对酶解产物进行基质辅助激光解吸- 飞行时间-串联质谱（MALDI-TOF-MS)分析。所得肽指纹图谱肌肽序列采用 Mascot搜索引擎搜索NCBInr数据库或Swissprot数据库。

1.6差异蛋白的验证：运用Westemblot法对差异蛋白进行免疫杂交验证。

2、构建肝纤维化无创诊断决策树

2.1检测血液学指标：采用直接ELISA法测定血浆中PrxII、CLU、HP, ApoAl的含量。采用放射免疫法测定血清中HA的含量。采用酶免法测定血清

中LN、CIV、PIIIP的含量。按常规检测或由全自动生化仪完成血清肝纤维化四 项指标HA、PIIIP、LN和C-IV以及其余17项血液生化指标测定。

表3是25个血液学指标诊断各级肝纤维化的AUC值。

表3

检测指标			临床病理
	健康	轻度纤维化	重度纤维化	早期肝硬化
A	0. 7396	0.6144	0. 3393	0. 4710
A/G	0. 6563	0. 6503	0. 3988	0. 3043
AFP	0. 0208	0. 3072	0. 6667	0. 8551
AKP	0. 3750	0.4510	0. 4167	0. 8986
Apo AI	0. 0420	0. 4840	0. 6900	0, 3910
AST/ALT	0. 2292	0. 2876	0. 6012	0.9130
CB	0. 3021	0. 4575	0. 4613	0. 8261
CHE	0. 7917	0. 5033	0. 5595	0. 1449
C-IV	0.0417	0. 2484	0. 7262	0.8551
CLU	0. 0620	0. 4640	0. 7143	0. 3620
G	0. 3854	0. 3758	0. 5208	0. 8043
HA	0. 1875	0. 4052	0. 4702	1. 0000
HB	0.3125	0.6176	0. 4077	0. 5942
HP	0. 5000	0. 4970	0. 5000	0. 5070
LN	0. 4375	0. 4935	0. 5625	0. 4058
PrxII	0. 3333	0.8301	0. 2857	0. 4058
PIIIP	0. 4063	0. 5065	0. 4792	0. 6014
PLT	0.3125	0. 6013	0. 5238	0. 3478
Pre	0. 8958	0. 4673	0. 5268	0. 2319
PT	0. 1042	0.3137	0. 6369	0. 8551
rGT	0. 1563	0. 5621	0. 4107	0. 8188
TB	0. 3750	0. 4706	0.4167	0.8551
TC	0. 5625	0. 5294	0. 3423	0. 7754
TG	0. 5625	0. 5065	0. 5060	0. 4275
WBC	0. 0625	0. 4444	0. 7140	0. 3768

2.2统计分析：计量资料数据以（x 土 s)表示，采用SPSS12.0统计软件进行 方差分析、多因素分析、Spearman等级相关分析、ROC曲线分析、决策树构建。

2.3构建肝纤维化无创诊断决策树：从上述4个血浆差异蛋白、4项血清纤 维化指标和17项临床血液学指标中，筛选出PT、Pre、HA和、PrxII4个指标， 构建了肝纤维化无创诊断的决策树，从而区分不同分期的肝纤维化。实践证实， 本发明所构建的肝纤维化无创诊断决策树的准确率高。

表4是决策树诊断临床样本的准确率。

成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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