国产化学发光试剂检测4项血清肝纤维化标志物 对肝纤维化诊断的应用分析与无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断方法

【摘要】目的探讨国产化学发光(CL)试剂检测血清肝纤维化标志物透明质酸(HA)、层粘连蛋白型前 胶原氨基端肽(PffiNP)、W型胶原(CW)对肝纤维化的诊断价值。方法采用CL法检测123例有病理诊断的慢性肝 炎患者（病例组）及30例健康体检者（对照组）的血清HA、LN、P瓜NP、C1V,病例组按纤维化程度分为S0~S4期，评价 4项指标对肝纤维化的诊断价值。结果病例组HA、LN、CIV明显高于对照组[(4.47±0.86)v_S. (2.02±0.23)，P = 0.000;(4.15±0.81) vs. (3.57±0.67)，P= 0.002;(3.49±0.89) vs. (2.15±0.81)，P= 0.000]。4 项指标均呈现对照组 <S0，S1< S2，S2>S3，S4期HA与CIV下降、LN与PlffNP升高。不同肝纤维化分期的患者中4项指标组间差异均有统计学意义 (P< 0.01)，4项指标的S0与S1期比较，差异无统计学意义（P> 0.05)，而S0与S2期、S1与S2期比较，差异均有统 计学意义(P< 0.05)。LN、PIHNP、CIV 3项指标与肝纤维化程度有正相关性(P均<0.01)。诊断肝纤维化的受试者工作 特征曲线(R0C 曲线）下面积(AUC)依次为 CIV(0.790>HA(0.775)>LN(0.725)>PffiNP (0.644hHA、HA+LN+CW 3 项 联合、4项联合对肝纤维化诊断的敏感性及准确率较高；综合诊断效能CIV>LN>PHI]VP;单项及联合检测的阳性似然 比为1〜3。结论4项指标对肝纤维化诊断均有一定价值，但对早期肝纤维化诊断的意义有限，当纤维化程度为S2 期时，其意义最明显。随着肝纤维化程度加重，HA与CW反呈下降趋势，可能与细胞外基质的分解降低有关。多指标 联合适合在排除肝纤维化时应用；所有单项及联合检测对诊断肝纤维化的阳性似然比均较低，说明其诊断价值有限，

不能替代肝组织活检。

血清肝纤维化标志物的检测作为一种非创伤性 辅助肝纤维化诊断方法，具有较大的应用价值。其中 透明质酸（hyaluronic acid, HA)、层粘连蛋白 (laminin, LN)、DI 型前胶原（procollagen type 瓜，PC DI)、IV型胶原(collagen type IV, CIV)是临床常用的 血清标志物w。郑敏等^pw+pcm与pcm氨基端肽(p Iff NP)在肝纤维化诊断中的敏感性、特异性进行比 较,发现两者无明显差异。化学发光(CL)法作为一 种较成熟的免疫检测方法，已广泛应用于临床检测 及科学研究，其敏感性与特异性较传统酶联免疫法 都有所提高。近年来，已有一些检测肝纤维化标志物 的国产CL试剂问世。我们于2011年11月至2012 年1月对123例慢性肝炎患者采用国产CL试剂检 测4项血清肝纤维化标志物，结合病理诊断，分析其 对肝纤维化的诊断价值，报告如下。

对象与方法

一、    一般资料

病例组123例，男75例，女48例；年龄 15~70岁，平均(38.9士13.6)岁；所有患者均经病理检 查确诊为不同肝纤维化分期的慢性肝炎。按照病理 肝纤维化程度分为5期，即S0、S1、S2、S3、S4。病理 诊断依据2000年中华医学会西安会议修订的《病毒 性肝炎防治方案》中关于病理学肝脏纤维化分期的 诊断标准判定，S0为无纤维化，為S1为有纤维化^[1]。 收集30例健康体检者作为正常对照组，男17例，女 13例;年龄23~57岁，平均(40.1±10.7)岁。其年龄与 性别构成与病例组无明显差异(户< 0.05)。

二、    方法

1.  资料及标本采集：收集两组的血清样本和患 者的病历资料。所有样本均为空腹静脉采血3 ml，经 离心分离血清，保存于-80 t冰箱待测。

2.  检测方法：4项血清肝纤维化标志物包括 11入、1^、？111邪、(：1¥。采用（^法（试剂购自北京源德 生物医学工程有限公司），其中HA为竞争法，其余3 项为双抗体夹心法。采用与其配套的化学发光免疫 分析仪JETLIA-962检测，参考范围（|xg/L)分别为 HA<120、LN<130、PIDNP<12、CIV<140。检测过程严 格按各项试剂、仪器说明书标准操作。

三、统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以5 ± s表 示,P< 0.05为差异具有统计学意义。先对每组数据 进行正态性检测，部分组别直接指标为非正态分布， 对所有指标进行自然对数转换后均呈正态分布(Z = 0.397~1.010，jP= 0.259~0.997)，继而可采用配对 t 检 验、单因素方差分析对其自然对数转换值进行均数 比较，并对其进行Pearson及Spearman相关性分析， 绘制受试者工作特征曲线(R0C曲线计算R0C曲 线下面积(AUC)及各项诊断效能评价指标(敏感性、 特异性、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似 然比、阴性似然比、诊断准确率

结 果

一、两组血清肝纤维化标志物结果的比较

病例组HA、LN、PDINP、CIV4项指标普遍升髙， 与正常对照组比较,HA、LN、C1V3项指标的差异具 有统计学意义(P均<0.01),见表1。

表1  两组血清肝纤维化标志物结果的比较

组别	例数	HA	LN	phinp	CIV
对照组	30	2.02±0.23	3.57±0.67	1.31±0.56	2.15±0.81
病例组	123	4.47±0.86	4.15±0.81	1.50±0.90	3.49土0.89
t值		15.432	3.426	1.065	6.272
尸值		0.000	0.002	0.296	0.000

二、    不同肝纤维化分期患者血清肝纤维化标志 物结果的比较

病例组各分期（S0~S4)患者及正常对照组的4 项检测结果见表2。4项均呈现正常对照组<S0，S1< S2,S2>S3，S4期的HA与C1V继续下降,LN与PM NP反而升高；4项指标在正常对照组均为最低； 除LN为S4期最高外，其余3项均为S2期最高。

采用单因素方差分析法比较，结果显示4项指 标组间差异均有统计学意义(P均<0.01)。进一步采 用LSD-t检验进行各组间的两两比较，结果见表3。 除PINP外，其余3项的对照组与不同分期的病例 组间差异均具有统计学意义（P均<0.05);4项的 S0与S1期比较,差异均无统计学意义(P均>0.05); 而S0与S2期、S1与S2期比较，差异均有统计学意 义均<0.05)«^111即的S2期与其他各组比较差异 均有统计学意义（P均<0.05);HA、LN的S4期与其 他各组比较差异均有统计学意义(P均矣0.01)。

三、    血清肝纤维化标志物之间及其与纤维化程 度的相关性分析

采用Pearson法对所有153例样本中4项血清 肝纤维化标志物两两之间进行相关性分析，均具有 统计学意义(i³均<0.01),其中C1V与其他3项的相 关性最好(表4)。采用Spearman等级相关法对123 例血清肝纤维化标志物与肝纤维化分期进行相关性 分析，除HA外，其余3项指标与纤维化程度均呈正 相关(P均<0.01)，见表5。

表4  4项血清肝纤维化标志物两两之间的相关系数r

项目	HA	LN	PINP	CIV
HA	-	0.301	0.368	0.667
LN	0.301	-	0.361	0.428
PINP	0.368	0.361	-	0.545
CIV	0.667	0.428	0.545	-

北京医学2012年第34卷第3期 表3  血清肝纤维化标志物在不同组间两两比较的P值

(LSD-f 检验)

比较组别	HA	LN	PINP	C1V
对照组与
S0	0.000	0.015	0.190	0.000
S1	0.000	0.003	0.421	0.000
S2	0.000	0.000	0.000	0.000
S3	0.000	0.000	0.056	0.000
S4	0.000	0.000	0.006	0.000
so与
S1	0.791	0.918	0.479	0.776
S2	0.048	0.002	0.000	0.030
S3	0.072	0.048	0.491	0.038
S4	0.000	0.000	0.134	0.072
S1与
S2	0.044	0.001	0.000	0.027
S3	0.070	0.031	0.157	0.035
S4	0.000	0.000	0.021	0.074
S2与
S3	0.864	0.303	0.003	0.929
S4	0.000	0.010	0.032	0.751
S3与
S4	0.000	0.000	0.441	0.818

四、血清肝纤维化标志物诊断肝纤维化(&S1 期)的能力评价

绘制ROC曲线，得出4项指标诊断肝纤维化的 AUC 依次为 CIV(0_790)>HA(0.775)>LN(0_725)> PIHNP(0.644),见图1。选择“敏感性+特异性-1值 (即约登指数)最大”状态下的血清值为诊断界值，得 出11入、1^、？]11~?、(：1¥诊断肝纤维化的界值分别为 15.433、57.533、5.385、31.014。将&该界值定义为阳 性，以病理结果为金标准计算该诊断界值下的敏感 性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、

表2  对照组与肝纤维化各期患者血清肝纤维化标志物结果的比较(* ± 4

分组与分期	例数	HA	LN	PINP	CW
对照组	30	2.02±0.23	3.57±0.67	1.31±0.56	2.15±0.81
病例组	123
so期	23	4.74±0.74	4.18±0.84	1.61±0.88	3.64±0.84
S1期	50	4.79±0.69	4.21±0.86	1.46±0.93	3.70±0.90
S2期	17	5.21±0_79	5.07±0.93	2.63±0.65	4.29±1.08
S3期	17	5.17±1.08	4.75±1.13	1.79±0.99	4.26±1.11
S4期	16	3.80±1.03	5.89±1.11	2.01±0.72	4.19±0.99

表5 血清肝纤维化标志物直接指标与肝纤维化分期的 相关性分析

统计量	HA	LN	PINP	CIV
r值	-0.082	0.419	0.237	0.236
P值	0.367	0.000	0.008	0.009

阴性似然比、诊断准确率等评价指标；因PI1INP的 AUC最小，计算其余3项联合、全部4项联合后的 各评价指标，并对单项及联合后的诊断价值进行比 较(表6)。可见HA、3项联合、4项联合对肝纤维化 诊断的敏感性及准确率较高，其阴性似然比均<0.1, 说明其应用于排除肝纤维化时非常可靠，但特异性 均较低。HA+LN+CIV 3项联合的诊断效能略优于4 项联合;综合分析诊断效能为ClV>LN>PniNP，其单 项及联合诊断的阳性似然比为1~3。

讨 论

肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质丨ECM) 过度沉积，主要由于肝星状细胞激活，ECM生成过

R0C曲线

图1  4项血清肝纤维化标志物诊断肝纤维化(英S1期)的

ROC曲线

多，而降解相对不足，在肝内大量沉积所致。它是慢 性肝病的共同病理学基础，是发展至肝硬化的必经

阶段。

临床上肝组织活检仍为肝纤维化和肝硬化诊断 的金标准' 但肝活检是一种有创性检查，患者不易 接受，而且存在一定风险，检测结果很大程度受到取 材的影响，诸多因素限制其应用寻找并建立可 靠、特异性好且无创性的肝纤维化诊断指标是许多 研究者的目标^p~^12]。肝纤维化血清标志物主要包括 ECM及其裂解物、ECM代谢相关的酶、整合素/黏附 分子、相关细胞因子4大类，其中HA、LN、PCIH、 C1V被认为是较有实用价值的标志物，与肝纤维化分 期有一定相关性'研究表明，HA为ECM中最重要 的糖胺多糖成分，在肝纤维化早期血HA即见显著 增加，可较准确灵敏地反映肝内炎症及纤维化情 况。LN为基底膜中特有的非胶原性糖蛋白，与CIV 结合成细胞基底膜的骨架，即“肝窦毛细血管化”，可 作为反映基底膜变化的指标。P1ENP是反映间质胶 原合成的指标，CIV则是反映间质胶原降解的指标， 即反映基底膜胶原更新率的指标，CIV/PEINP比值 增大显示降解占优势，降低显示纤维沉积占优势％

上述4项指标的CL法检测在敏感性与特异性 方面都有提高，且其线性范围增宽，但对CL法与病 理的对照研究仍较少，且结论不尽相同本研究 显示除PIDNP外，其余3项指标的正常对照组与肝 纤维化各分期的病例组间差异均有统计学意义，即 使病理为S0期的3项指标也明显高于正常对照组。 此时除了考虑病理结果受取材的局限性及人为判读 误差的影响，还应考虑指标对炎症活动度的反映，因 为炎症始终是纤维化形成的重要因素so期病例 可因炎症导致4项指标有所变化。当病理结果判为 无炎症无纤维化（G0S0)时，与正常对照组的差异是 否具有统计学意义值得进一步研究。

项目	AUC	95%CI	敏感性 (%)	特异性 (%)	约登 指数	阳性预 测值(％)	阴性预 测值(％)	阳性 似然比	阴性 似然比	诊断准 确率(％)
HA	0.775	0.690-0.861	95.0	58.5	0.535	81.2	86.1	2.289	0.085	82.4
LN	0.725	0.644-0.806	71.0	69.8	0.408	81.6	56.1	2.351	0.415	70.6
PlNP	0.644	0.554〜0.733	60.0	71.7	0.317	80.0	48.7	2.120	0.558	64.1
CIV	0.790	0.712 〜0.868	77.0	73.6	0.506	84.6	62.9	2.917	0.313	75.8
HA+LN+CIV 3项联合	-	-	99.0	41.5	0.405	76.2	95.7	1.692	0.024	79.1
4项联合	-	-	99.0	32.1	0.311	73.3	94.4	1.458	0.031	75.8

4项指标均呈现正常对照组<S0, S1 <S2，S2>S3， 而4项的SO与S1期的差异均无统计学意义，说明 病例组的肝纤维化程度累积到S2期时,4项指标才 有显著性变化，到S3期便开始不同程度的下降。S4 期HA与C1V继续下降，LN与P1ENP反弹升高，但 只有HA、LN的S4期与其他各组的差异具有统计学 意义；除LN为S4期最高，其余3项均为S2期最 高。这与文献报道的4项指标随着肝纤维化分期持 续升高的结果不同，考虑与随着病情进展，肝脏基 质合成分解过程也随之减慢有关。薛永杰等™的研究 曾观察到类似表现，不同的是其到S4期各项指标才 下降。研究还显示S4期反映基底膜损伤的LN独自 升高，提示病情进一步恶化。

4项指标两两之间均有显著相关性，适合联合 检测，其中CIV与其他3项的相关性最好。除HA 外，其余3项在不同程度上均与肝纤维化程度呈正 相关，表明这些指标可用于监测慢性肝炎的纤维化 进展。R0C曲线的AUC依次为CIV (0.790)>HA (0_775) >LN (0.725) >P HI NP(0.644) >0.500,4 项指标 对肝纤维化均有一定诊断价值。其中HA、HA+LN+ CIV 3项联合、4项联合对肝纤维化诊断的敏感性及 准确率较高，其阴性似然比均<0.1,说明其应用于排 除肝纤维化时非常可靠，但特异性均较低。综合诊断 效能为ClV>LN>PnNP,但单项诊断准确率均不高， 因此不适合单项诊断肝纤维化，最好进行联合检测、 综合分析。所有单项及联合检测的阳性似然比均为 1~3,说明其诊断肝纤维化的价值有限，还需结合其 他无创检测，更不能替代肝组织活检这一金标准。

本研究显示PHINP结果呈现波动性，虽有类似 其他3项的变化趋势，但未能表现出统计学差异。有 研究表明，P1ENP在一定程度上反映炎症程度的变 化，但不能反映纤维化程度h'本研究结果亦支持 此结论。建议医师分析4项血清肝纤维化标志物结 果时重点观察HA、LN、C1V3项结果。如必要时可考 虑重新建立组合，以方便临床诊疗。HA被认为是所 有血清肝纤维化标志物中最具临床实用价值的一个 指标有研究显示，HA在肝纤维化不同分期间 的差异均有统计学意义，其敏感性为56.0%、特异性 为93.0%、准确率为82.9%[⁹，¹⁰¹;而本研究结果依次为

95.0%、58.5%、82.4%,显示其敏感性高、特异性差， 但准确率却相当。其他研究的结果也不尽相同，分析 其原因可能有：①检测试剂不同，尤其是免疫学检 测，不同的检测系统可能会导致较大的差异性；② HA检测采用竞争法，其稳定性差，手工法自身批间 差异较大，且竞争法较其他3项操作步骤更加复杂， 影响因素较多，结果的稳定性、可靠性有待进一步研 究％;③选取研究病例的数量与范围不尽相同。

成都华西华科研究所研发生产无创肝纤维化肝硬化早期检测诊断仪

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